Số liệu thu được được xử lý và vẽ đồ thị trên bảng tính Excel 2016.
Kết quả được trình bày dưới dạng x̅ ± SD, trong đó x̅ là giá trị trung bình, SD là độ lệch chuẩn (n=3)
Phương pháp phân tích thống kê trong phân tích dược động học và phân tích thống kê:
Các thông số dược động học của acid fenofibric từ mẫu huyết tương thu được trong quá trình đánh giá sinh khả dụng sẽ được xác định bằng phần mềm Phoenix WinNonlin 8.2 theo mô hình dược động học không ngăn (Non compartmental analysis) từ dữ liệu nồng độ thuốc theo thời gian của các cá thể chó. AUClast được tính theo phương pháp hình thang tuyến tính (linear trapezoidal summation). Phần mềm Phoenix sẽ tự động xác định các điểm đưa vào tính Lambda Z, hằng số tốc độ liên quan đến đoạn cuối pha thải trừ dựa trên dữ liệu nồng độ.
31
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả xây dựng phương pháp định lượng fenofibrat
3.1.1. Phương pháp quang phổ UV- VIS
Tiến hành đo độ hấp thụ quang của dãy dung dịch chuẩn FB trong dung dịch NaLS 0,72% với các nồng độ trong khoảng 2,0-15,0 μg/ml.
Kết quả: Phương trình thể hiện mối liên hệ giữa nồng độ FB với độ hấp thụ quang:
y = 0,0471x + 0,0105, R2 = 0,9997. Như vậy khoảng nồng độ khảo sát có mối quan hệ tuyến tính với độ hấp thụ quang. Do đó, nồng độ fenofibrat trong các mẫu thử có thể được xác định bằng cách so sánh với mẫu chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng 2,0 -15,0 µg/ml.
3.1.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC)
Phương pháp HPLC dùng trong định lượng FB được thẩm định các chỉ tiêu về tính tích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng. Kết quả chi tiết thẩm định thể hiện ở Phụ lục 1.
Kết quả tóm tắt: Các yêu cầu về chỉ tiêu đạt. Có thể sử dụng phương pháp HPLC để đánh giá chỉ tiêu định lượng và độ hoà tan của viên nén.
Bảng 3.1. Tóm tắt kết quả thẩm định phương pháp HPLC
Chỉ tiêu Yêu cầu Kết quả
Tính tích hợp hệ thống
Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu RSD ≤ 1% và của diện tích peak RSD ≤ 2%.
RSD thời gian lưu= 0,08% RSD diện tích peak=0,14% Độ
tuyến tính
Đường chuẩn có dạng y=ax+b có 1) R2 ≥0,999 2) b/Spic ≤ 2,0% Định lượng y = 0,0471x + 0,0105, R2 = 0,9997 Độ hoà tan: y = 32522x+ 239311, R2 = 0,9992 b/ Spic= b/Speak ~0 Độ đúng Tỉ lệ thu hồi= Lượng Feno chuẩn
thêm vào/ Lượng Feno thu hồi nằm trong khoảng 98,0- 102,0%
Trong một mức thêm chuẩn, RSD tỉ lệ thu hồi ≤ 2,0%
32 Độ đặc
hiệu
Trên sắc kí đồ, mẫu trắng và mẫu placebo không có peak tại thời gian lưu của peak chính fenofibrat trong dung dịch thử và dung dịch chuẩn. Mẫu thử và mẫu chuẩn có peak cùng thời gian lưu
Đạt Độ lặp lại cùng ngày và khác ngày
RSD kết quả 6 mẫu ngày đầu tiên ≤ 2,0 %
RSD Kết quả gộp 12 mẫu ≤ 2,0 %
Đạt
3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng yếu tố công thức và quy trình nghiền bi
Nghiên cứu [8] đã khảo sát và xây dựng được công thức và thông số quy trình trên thiết bị Nghiền bi Restch MM200 ở quy mô 20 viên/ lô. Để nâng quy mô lên 1000 viên/ lô, tiến hành bào chế tiểu phân nano FB trên thiết bị máy nghiền bi kiểu đứng XQM- 2A. Tham khảo các kết quả từ nghiên cứu [8], tiến hành nâng quy mô lên 15g FB/ cối nghiền cho một lần nghiền theo phương pháp ở mục 2.3.1 với công thức cho một cối nghiền và thông số quy trình như sau:
Công thức nghiền cho 1 cối- Thông số quá trình
Bảng 3.2. Công thức khảo sát sơ bộ quá trình nghiền
FB 15 g Khối lượng bi
Ziconium 5 mm
500g bi HPMC E6 0,25 g Thời gian nghiền 3 giờ
HPC 0,5 g Tốc độ nghiền 500 rpm
Nước 50 ml
Đánh giá dịch nghiền thu được theo phương pháp ở mục 2.3.2. Kết quả đánh giá hỗn dịch thu được như sau:
- KTTP: 450,1 ± 24,9 nm - PDI: 0,318 ± 0,030
- Hàm lượng dược chất sau li tâm 1000 rpm: 33,28%
Nhận xét: Kết quả thu được cho thấy hỗn dịch thu được sau khi nghiền có hàm lượng dược chất sau li tâm 1000 rpm thấp hơn nhiều với kết quả thu được từ mẫu bột viên chứng sau li tâm (65,24%). Do sự khác biệt về cơ chế làm nhỏ KTTP và chuyển động của bi trong 2 loại thiết bị [47], cần tiến hành khảo sát thay đổi các yếu tố về công thức và quá trình để tăng hàm lượng DC nano trong dịch nghiền.
33
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố công thức dịch nghiền
3.2.1.1. Ảnh hưởng của chất diện hoạt anion
Tham khảo kết quả công bố ở patent viên nén fenofibrat 145 mg [55] lựa chọn khảo sát ảnh hưởng sự có mặt của chất diện hoạt anion ở nồng độ thấp đến đặc tính tiểu phân FB. Với đặc điểm thiết bị có thể bào chế 4 công thức khác nhau đồng thời, tiến hành bào chế với các loại chất diện hoạt là NaLS, DOSS ở nồng độ 0,08% và 0,16% theo phương pháp ở mục 2.3.1 và kết quả được thể hiện như sau:
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của CDH anion đến HLDC trong HDBC sau li tâm
NT1 NT2 NT3 NT4 FB (g) 15 15 15 15 HPMC E6 0,25 0,25 0,25 0,25 HPC 0,5 0,5 0,5 0,5 NaLS 0,04 (0,08%) - 0,08 (0,16%) - DOSS - 0,04 (0,08%) - 0,08 (0,16%) Nước 50,0 50,0 50,0 50,0 HLDC sau li tâm 1000 rpm (%) 37,82 41,18 36,27 39,01
Hình 3.1. Ảnh hưởng của CDH anion đến KTTP hệ nano
Nhận xét:
Khi sử dụng NaLS và DOSS ở nồng độ thấp hơn CMC tương ứng, hệ tiểu phân thu được có đặc tính (HLDC sau li tâm 1000rpm và KTTP) cải thiện đáng kể so sánh với
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 300 320 340 360 380 400 420 440 460
DOSS 0,08% DOSS 0,16% NaLS 0,08% NaLS 0,16% Không CDH
PDI KT T P (n m ) KTTP PDI
34
công thức không sử dụng các chất diện hoạt anion trên. Điều này được lí giải nhờ khả năng tăng thấm ướt dược chất, giảm sức căng bề mặt và ổn định tĩnh điện của các CDH [28], [42]. Khi sử dụng NaLS ở cả 2 mức nồng độ 0,08% và 0,16% và DOSS ở nồng độ 0,16% hỗn dịch thu được xuất hiện nhiều bọt, bọt khí sinh ra làm cản trở chuyển động va chạm làm nhỏ dược chất, nên hiệu quả nghiền thu được kém hơn. Điều này có thể do khả năng tạo bọt và giá trị HLB của NaLS cao hơn nhiều so với DOSS. Khi sử dụng DOSS thêm vào công thức ban đầu, ở tỉ lệ 0,08% hệ tiểu phân thu được có đặc tính HLDC và KTTP tốt nhất( 420,5±8,73nm). Do vậy, chọn DOSS ở tỉ lệ 0,08% thêm vào công thức cho những khảo sát tiếp theo.
3.2.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ HPMC E6
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ HPMC E6 đến đặc tính tiểu phân nano FB, kết quả được thể hiện như sau:
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ dd HPMC E6 đến HLDC trong HDBC sau li tâm NT2 NT5 NT6 NT7 FB (g) 15 15 15 15 HPMC E6 (g) 0,25 (0,5%) 0,5 (1,0%) 0,75 (1,5%) 1,0 (2,0%) HPC (g) 0,5 0,5 0,5 0,5 DOSS (g) 0,04 0,04 0,04 0,04 Nước (ml) 50 50 50 50 HLDC sau li tâm 1000 rpm (%) 40,58 45,27 49,89 47,35 Hình 3.2. Ảnh hưởng nồng độ dd HPMC E6 đến KTTP hệ nano 0,12 0,14 0,16 0,18 0,2 0,22 0,24 0,26 0,28 0,3 300 320 340 360 380 400 420 440 0,50% 1,00% 1,50% 2,00% PDI KT T P (n m ) KTTP PDI
35 Nhận xét:
Khi tăng nồng độ dung dịch HPMC E6 từ 0,5% đến 1,5%, KTTP giảm đồng thời HLDC sau li tâm tăng dần, khi tăng từ 1,5 lên 2,5%, HLDC có xu hướng giảm dần đồng thời KTTP cũng tăng dần. Điều này có thể giải thích do khi tăng nồng độ HPMC E6 lên 1.5%, chuyển động của bi chưa bị cản trở, nồng độ HPMC E6 cao hơn giúp ngăn cản quá trình kết tụ tiểu phân nhờ tương tác với tiểu phân dược chất và tạo môi trường có độ nhớt nhất định giúp ngăn cản chuyển động và kết tụ dược chất [38]. Tuy nhiên, khi nồng độ HPMC E6 tiếp tục tăng, độ nhớt của hệ tăng quá cao cản trở quá trình ma sát giữa bi nghiền với dược chất và làm giảm hiệu quả của quá trình nghiền. Trong các công thức khảo sát, công thức N5 với nồng độ HPMC E6 là 1.5% có hàm lượng dược chất sau li tâm là cao nhất, hệ tiểu phân nano thu được có KTTP bé nhất (385,3±4,81 nm). Vì vậy, chọn công thức dịch nghiền N5 cho các khảo sát thông số quá trình tiếp theo.
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố quy trình
Chuyển động của bi nghiền trong cối nghiền là chuyển động phức tạp. Tốc độ thấp sẽ làm giảm khả năng văng của bi, do đó làm giảm hiệu quả nghiền, ngược lại tốc độ cao gây ra chuyển động li tâm [3].
Với thông số hiện tại của thiết bị, lựa chọn tốc độ nghiền là 500 rpm để đảm bảo chuyển động của bi và đảm bảo vận hành an toàn của thiết bị.
3.2.2.1. Ảnh hưởng của thể tích dịch nghiền
Với mục đích nâng cao hiệu suất nghiền, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của lượng dịch nghiền đến hiệu suất nghiền ở 4 mức thể tích là 50, 75, 100, 125 ml dịch nghiền và kết quả thu được như sau:
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thể tích dịch nghiền đến HLDC trong HDBC sau li tâm
NT6 NT8 NT9 NT10
Thể tích dịch nghiền (ml) 50 75 100 125
FB (g) 15,0 22,5 30,0 37,5
HLDC sau li tâm 1000 rpm (%) 48,78 46, 13 28,72 24,97 Nhận xét:
Khi tăng dần thể tích dịch nghiền bi từ 50 đến 125ml, hệ tiểu phân nano thu được có HLDC sau li tâm có xu hướng giảm dần. Với quá trình nghiền bi, nước có vai trò làm giảm ma sát giữa các bi, hạn chế nhiễm tạp, tuy nhiên thể tích dịch nghiền càng tăng sẽ
36
làm cản trở chuyển động của bi, khó tạo ra chuyển động hỗn hoạn, va đập làm nhỏ dược chất.
Khi thể tích là 75 ml dịch nghiền, HLDC sau li tâm không thấp hơn đáng kể so với khi nghiền 50 ml tuy nhiên xét về tổng lượng dịch thu được sau cùng thời gian nghiền lại là lớn hơn 1,5 lần. Vì vậy lựa chọn thể tích dịch nghiền là 75 ml cho khảo sát tiếp theo.
3.2.2.2. Ảnh hưởng của thời gian nghiền
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian nghiền bằng cách nghiền với thời gian tăng dần là 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ, 6 giờ thu được kết quả như sau:
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian nghiền đến HLDC trong HDBC sau li tâm
NT6.1 NT6.2 NT6.3 NT6.4
Thời gian 3 giờ 4 giờ 5 giờ 6 giờ
HLDC sau li tâm
1000 rpm (%) 46, 13 54,24 60,81 58,02
Nhận xét:
Khi tăng thời gian nghiền bi từ 3 giờ lên 5 giờ, hệ tiểu phân nano thu được có HLDC sau li tâm 1000 rpm có xu hướng tăng dần. Khi tăng thời gian nghiền bi, quá trình va đập giữa DC với bi nghiền diễn ra lâu hơn, kết quả hệ tiểu phân thu được có HLDC sau li tâm tăng. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng thời gian nghiền lên 6 giờ, các tiểu phân dược chất được làm nhỏ tối đa nhưng thời gian nghiền kéo dài quá lâu dẫn tới tăng khả năng kết tụ tiểu phân DC [50]. Thời điểm 5 giờ cho hàm lượng dược chất sau li tâm tốt nhất. Vì vậy chọn thời gian nghiền là 5 giờ.
Qua các khảo sát trên thu được công thức và thông số quy trình bào chế hỗn dịch nano như sau:
Bảng 3.7. Công thức và thông số lựa chọn nghiền bi lựa chọn
1 cối 4 cối Công thức NT6.3 Fenofibrat (g) 22,5 90 HPMC E6 (g) 1,125 4,5 HPC (g) 0,75 3 DOSS (g) 0,06 0,24
Nước tinh khiết (ml) 75 300 Thông số
nghiền bi
Khối lượng bi
37
Tốc độ nghiền 500 rpm
Thời gian 5 giờ
3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng yếu tố công thức tạo hạt
Tiến hành bào chế hỗn dịch nano theo công thức, thông số quá trình nghiền ở bảng 3.7. Bổ sung các TD vào hỗn dịch nano thu được từ 75 ml dịch nghiền trên, tiến hành phun tạo hạt với 30 g nhân trơ SuperTab 11SD theo phương pháp nêu ở mục 2.3.1. Xác định hàm lượng dược chất sau khi phân tán và li tâm 1000 rpm theo phương pháp nêu ở mục 2.3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng các TD thêm vào dịch nghiền đến đặc tính (HLDC sau phân tán và li tâm 1000 rpm) của cốm nano fenofibrat thu được.
3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của loại đường trong dịch phun
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của việc sử dụng các loại đường khác nhau trong dịch phun đến khả năng tái phân tán của cốm fenofibrat, cố định nồng độ đường=30%, khối lượng đường= 22,5g, kết quả như sau:
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của loại đường đến đặc tính cốm fenofibrat
TD thêm vào P1 P2 P3 P4 Manitol - 22,5 - - Sucrose - - 22,5 - Lactose - - - 22,5 HLDC sau li tâm 1000 rpm (%) 21,82 30,37 30,54 26,27 Khả năng phun bồi dần Hạt tròn cầu, trơn chảy tốt Hạt tròn cầu, trơn chảy tốt Dễ dính hạt Hạt tròn cầu, trơn chảy tốt Nhận xét:
Việc sử dụng thêm đường vào hỗn dịch trước khi phun giúp cải thiện HLDC của cốm FB trong nước sau khi phun. Điều này có thể giải thích do quá trình phun sấy, các phân tử chất tan khi phun tạo kênh cầu nối rắn [14], bao quanh tiểu phân fenofibrat, hạn chế quá trình kết tụ, đồng thời khi phân tán trong nước, tạo các kênh dẫn nước để nhanh chóng giải phóng dược chất ra môi trường [25] .
Hiệu quả cải thiện khả năng tái phân tán của Manitol và Succrose tốt hơn Lactose khi thêm vào công thức dịch phun. Do khả năng phun bồi dần trong thiết bị tầng sôi, sử dụng Succrose trong công thức dễ gây dính hạt, vì vậy lựa chọn Manitol cho các khảo sát tiếp theo.
38
3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Manitol trong dịch phun
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Manitol trong hỗn dịch ở các mức 20%, 30%, 40%. Kết quả như sau:
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ Manitol đến đặc tính cốm fenofibrat
TD thêm vào P5 P4 P6 Manitol 20% (15 g) 30% (22,5 g) 40% (30 g) HLDC sau li tâm 1000 rpm (%) 25,22 30,18 30,27 Nhận xét:
Khi sử dụng Manitol ở nồng độ 30% và 40%, khả năng tái phân tán của cốm FB thu được là như nhau và tốt hơn khi sử dụng 20%. Do vậy, lựa chọn nồng độ Manitol là 30%.
3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ DOSS trong dịch phun
Khảo sát ảnh hưởng của khối lượng DOSS thêm vào hỗn dịch ở các mức 0,06g, 0,18g, 0,42g, 0,90g. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ DOSS đến đặc tính cốm fenofibrat
TD thêm vào P4 P7 P8 P9 P10 Manitol (g) 22,5 22,5 22,5 22,5 22,5 DOSS - 0,06 0,18 0,42 0,90 HLDC sau li tâm 1000 rpm (%) 30,08 35,90 38,07 41,79 41,90 Nhận xét:
Khi khối lượng DOSS thêm vào tăng dần đến 0,42 g, HLDC của cốm fenofibrat sau li tâm 1000 rpm tăng dần. Điều này có thể giải thích do khả năng tăng thấm nước của DOSS trong cốm kết hợp với việc ổn định hệ theo cách tĩnh điện [32], [33]. Tuy nhiên khi lượng DOSS thêm vào tăng lên 0,9 g, HLDC không thay đổi. Vì vậy, lựa chọn khối lượng DOSS thêm vào là 0,42 g cho các khảo sát tiếp theo.
3.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ HPMC E6 trong dịch phun
Khảo sát ảnh hưởng của khối lượng HPMC E6 thêm vào trong hỗn dịch ở các mức 0,375 g; 1,125 g; 1,875 g. Kết quả thu được như sau:
39 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ HPMC E6 TD thêm vào P9 P11 P12 P13 Manitol (g) 22,5 22,5 22,5 22,5 DOSS (g) 0,42 0,42 0,42 0,42 HPMC E6 (g) - 0,375 1,125 1,875 HLDC sau li tâm 1000 rpm (%) 41,14 49,05 56,27 56,12
Nhận xét: Khi khối lượng HPMC E6 thêm vào hỗn dịch tăng dần từ 0,375 g lên 1,125 g, HLDC tăng dần. Điều này giải thích do khả năng bao phủ tiểu phân nano khi rắn hoá hỗn dịch nano và giảm thiểu sự kết tụ của các tiểu phân nano trong quá trình sấy