Chẩn đoán nhiễm CMV không chắc chắn nếu chỉ dựa vào lâm sàng.
1.2.3.1 Chẩn đoán trực tiếp
a. Phƣơng pháp phân lập vi rút:
Kể cả nghiên cứu nội bào bao quanh bởi một vòng halo rõ ràng cho thấy nhiều chủng khác nhau (nhuộm Giemsa, Wright, hematoxylin-eosin, Papanicolaou). Điều này cho thấy sự hiện diện hình ảnh mắt cú đặc trƣng ("owl's eye") [2], [17], [125].
Hematoxylin-eosin–stained lung section showing typical owl-eye inclusions (480X). Courtesy of Danny L Wiedbrauk, PhD, Scientific Director, Virology & Molecular
Biology, Warde Medical Laboratory, Ann Arbor, Michigan.
Hình 1.5: Hình ảnh “mắt cú”
b. Phƣơng pháp phát hiện nhanh vi rút bằng kỹ thuật phát hiện kháng nguyên, PCR
CMV đƣợc đào thải qua nƣớc bọt, nƣớc tiểu, chất dịch phế quản nhiều tháng sau khi bị bệnh. Phân lập vi rút bằng cấy bệnh phẩm trên nguyên bào sợi ngƣời, phát hiện sự nhân lên của vi rút thông qua hiện tƣợng bệnh lý tế bào bệnh lý đặc hiệu.Nhiều phƣơng pháp phát hiện kháng nguyên bằng kỹ thuật:
Xác định kháng nguyên huỳnh quang sớm:
Bệnh phẩm nuôi cấy tế bào sau một đêm ủ cho phản ứng với kháng thể đơn dòng chống lại CMV gắn với huỳnh quang. Phản ứng này với protein sớm và có thể phát hiện nhiễm CMV 3 giờ trong khi nhiễm. Nhuộm thấy đậm độ của hạt nội nhân đáng chú ý. Các hình thức nhuộm nhân khác hoặc bào tƣơng đều chƣa cụ thể. Trên các quần thể ghép tạng, sử dụng kỹ thuật phát hiện kháng nguyên hoặc phát hiện vật liệu di truyền để xác định chẩn đoán và điều trị.
Hình 1.6: Hình ảnh CMV dưới kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang mẫu bệnh phẩm mô phổi người do Dr. Craig Lyerla
Xác định kháng nguyên bạch cầu (CMV antigenemia):
Các tế bào đơn nhân từ máu ngoại vi đƣợc tách ly tâm rồi nhuộm với kháng thể đơn dòng gắn enzyme hoặc huỳnh quang. Test kháng nguyên trong máu đánh giá bằng số lƣợng tế bào lympho trình diện kháng nguyên pp55 bề mặt tế bào lympho Tc, giúp các tế bào này nhận biết và tiêu diệt tế bào bị nhiễm.
Kháng nguyên trong máu đƣợc xác định khi phát hiện đƣợc kháng nguyên CMV pp65 trong bạch cầu.
Thử nghiệm pp65 dùng phát hiện thông tin protein cơ chất trên vi rút CMV, hoặc làm kỹ thuật IFA hoặc khuếch đại chuỗi ARN thông tin. Các loại protein này chỉ trình diện trong quá trình sao chép vi rút.
Thử nghiệm kháng nguyên thƣờng là các xét nghiệm cơ bản của các viện trong vấn đề trị liệu thuốc chống vi rút ở các đối tƣợng ghép tạng và có thể cho phép phát hiện bệnh lý ẩn lâm sàng trên nhóm bệnh nhân có nguy cơ cao. Thử nghiệm có độ nhạy và đặc hiệu lại cho kết quả nhanh.
Thử nghiệm kháng nguyên không thể sử dụng trên các bệnh nhân có giảm bạch cầu, vì các test này phát hiện kháng nguyên trong bạch cầu trung tính;
Trên những bệnh nhân suy giảm miễn dịch, kháng nguyên trong máu CMV mức độ nhẹ hoặc trung bình có thể chỉ ra sự tái hoạt hoặc nhiễm trùng CMV.
Ngƣời ta đã báo cáo thử nghiệm kháng nguyên pp65 và phƣơng pháp CMV PCR định lƣợng (COBAS Amplicor Monitor Test) có hiệu quả trong chẩn đoán và giám sát các bệnh nhân nhiễm CMV tái hoạt động [28], [125].
+ Nhiễm nhẹ: 1-10/200.000 bạch cầu không có triệu chứng + Nhiễm vừa: 10-49/200.000 bạch cầu có triệu chứng + Nhiễm nặng: > 50/200.000 bạch cầu
Xác định ADN của vi rút trong bệnh phẩm bằng phản ứng khuếch đại chuỗi gen PCR.
Phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR) [3], [11]: PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn ADN mà không cần sử dụng các sinh vật sống nhƣ E.coli hay nấm men. PCR CMV hiện nay là phƣơng pháp có giá trị nhất trong chẩn đoán nhiễm CMV. Demmler GJ nghiên cứu thấy PCR-CMV trong nƣớc tiểu và máu tƣơng đƣơng nhau có độ nhạy là 93% và độ đặc hiệu là 100% khi chẩn đoán nhiễm CMV bẩm sinh [70]. PCR-CMV đƣợc thực hiện trên phƣơng pháp Real-time PCR, tùy theo phƣơng pháp chạy, kết quả có thể cho ta biết trong mẫu bệnh phẩm có ADN của CMV không (định tính) hoặc có bao nhiêu phân tử ADN- CMV trong mẫu đó (định lƣợng), tuy nhiên giá trị này là bao nhiêu thì có biểu hiện lâm sàng hiện nay vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu kỹ. PCR-CMV sẽ cho kết quả dƣơng tính khi có >100 bản sao/ml plasma [157].
PCR định tính (Qualitative PCR) đƣợc dùng để phát hiện CMV trong máu và các mẫu bệnh phẩm là mô;
PCR lệ thuộc vào quá trình sao chép các cặp mồi đặc hiệu cho vị trí gen CMV. Các cặp mồi thƣờng gắn với vùng của vi rút mã hóa cho các kháng nguyên sớm;
PCR định tính nhạy và có thể phát hiện AND của vi rút CMV trên bệnh nhân có hay không bệnh hoạt động nhƣng theo dõi dọc bệnh nhân lại có giá trị.
Kết quả âm tính chỉ ra các bệnh nhân không có vi rút CMVtrong máu; Trên những bệnh nhân ghép tạng, kết quả PCR âm tính cho biết sự tái hoạt nhƣng không nhiễm trùng.
-Xét nghiệm PCR định lƣợng (Quantitative polymerase chain reaction) PCR định lƣợng (Quantitative PCR) đã đƣợc dùng để phát hiện CMV trong huyết tƣơng. Lợi điểm của PCR định lƣợng hơn hẳn PCR thƣờng. PCR định lƣợng có độ nhạy nhƣ PCR định tính ngoài ra còn cung cấp ƣớc tính số gen nhiễm hiện diện trong huyết tƣơng;
Một nghiên cứu hơn 3400 mẫu máu từ các bệnh nhân ghép tạng bằng xét nghiệm PCR và thử nghiệm kháng nguyên pp65 trong máu thấy rằng RT- PCR có thể dùng thay thế cho định lƣợng kháng nguyên trong máu trong việc giám sát nhiễm CMV và xác định khi điều trị ƣu tiên;
Về mặt lý thuyết, lƣợng vi rút CMV sẽ chỉ ra liệu trình trị liệu cần thiết vì các bệnh nhân có lƣợng vi rút thấp dƣới 5000 bản sao/ml sẽ không phát triển thành bệnh CMV. Tuy nhiên, mức độ vi rút trong máu cần thiết xác định bệnh xảy ra có thể khác nhau tùy thuộc vào các yếu tố vật chủ và loại tạng ghép, và điều này cần xác định một cách thận trọng. Chẳng hạn, trên những viêm võng mạc do CMV, lƣợng vi rút có giá trị tiên đoán dƣơng kém, có nghĩa là tính thống nhất về lâm sàng kém.
Xét nghiệm PCR gồm có COBAS Amplicor CMV Monitor test (chỉ dùng trong nghiên cứu tại la bô), và Hybrid Capture System CMV AND test dùng định lƣợng, qualitative Hybrid Capture test (FDA chấp nhận). Vì lƣợng vi rút không thể so sánh trong số các thử nghiệm khác nhau, điều quan trọng là sử dụng các thử nghiệm giống nhau trên cùng loại mẫu bệnh phẩm (máu hoặc huyết tƣơng) khi giám sát bệnh nhân theo thời gian theo dõi.
Thử nghiệm trong vỏ (Shell vial assay)
Thử nghiệm trong vỏ (SVA) đƣợc thực hiện bằng cách thêm các mẫu bệnh phẩm lâm sàng vào trong một lọ nhỏ chứa các dòng tế bào cho phép với
CMV. Các lọ này đƣợc đem ly tâm tốc độ thấp và đặt vào trong tủ ấm. Sau 24 và 48 giờ, môi trƣờng nuôi cấy mô bị loại khỏi và lấy các tế bào nhuộm sử dụng chất.
Đánh dấu huỳnh quang kháng thể chống CMV
Các tế bào này đọc thông qua kính hiển vi huỳnh quang. Cũng có thể các tế bào nhuộm với kháng thể chống lại CMV, theo đó bởi một loại Ig miễn dịch đánh dấu huỳnh quang.
1.2.3.2 Chẩn đoán huyết thanh học
Nhiều kỹ thuật huyết thanh học dùng để xác định kháng thể kháng CMV trong huyết thanh bệnh nhân. Kháng thể IgM đƣợc xác định bằng miễn dịch liên kết enzyme hoặc miễn dịch huỳnh quang; kháng thể IgG xác định bằng kỹ thuật ELISA hoặc thử nghiệm ngƣng kết hồng cầu thụ động. Nồng độ kháng thể IgM thƣờng đƣợc tạo ra sớm sau nhiễm vi rút, IgM tăng hoặc có tăng gấp 4 lần nồng độ và hiệu giá kháng thể IgG trên các bệnh nhân có nhiễm CMV gần đây. IgM có thể tồn tại trong thời gian từ 1-3 tháng.. Kết quả CMV IgM dƣơng tính giả có thể nhìn thấy trên các bệnh nhân nhiễm EBV hoặc HHV-6, cũng nhƣ trên các bệnh nhân có nồng độ yếu tố thấp (RF) cao.
Một số thử nghiệm nhạy đủ để phát hiện kháng thể kháng CMV IgM sớm trong giai đoạn đầu của bệnh (kháng nguyên nhân CMV sớm, kháng nguyên CMV virus capsid) và trong khi có sự tái hoạt của CMV [17], [23], [28], [37].