b. Phƣơng pháp phát hiện nhanh vi rút bằng kỹ thuật phát hiện kháng nguyên, PCR
CMV đƣợc đào thải qua nƣớc bọt, nƣớc tiểu, chất dịch phế quản nhiều tháng sau khi bị bệnh. Phân lập vi rút bằng cấy bệnh phẩm trên nguyên bào sợi ngƣời, phát hiện sự nhân lên của vi rút thông qua hiện tƣợng bệnh lý tế bào bệnh lý đặc hiệu.Nhiều phƣơng pháp phát hiện kháng nguyên bằng kỹ thuật:
Xác định kháng nguyên huỳnh quang sớm:
Bệnh phẩm nuôi cấy tế bào sau một đêm ủ cho phản ứng với kháng thể đơn dòng chống lại CMV gắn với huỳnh quang. Phản ứng này với protein sớm và có thể phát hiện nhiễm CMV 3 giờ trong khi nhiễm. Nhuộm thấy đậm độ của hạt nội nhân đáng chú ý. Các hình thức nhuộm nhân khác hoặc bào tƣơng đều chƣa cụ thể. Trên các quần thể ghép tạng, sử dụng kỹ thuật phát hiện kháng nguyên hoặc phát hiện vật liệu di truyền để xác định chẩn đoán và điều trị.
Hình 1.6: Hình ảnh CMV dưới kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang mẫu bệnh phẩm mô phổi người do Dr. Craig Lyerla
Xác định kháng nguyên bạch cầu (CMV antigenemia):
Các tế bào đơn nhân từ máu ngoại vi đƣợc tách ly tâm rồi nhuộm với kháng thể đơn dòng gắn enzyme hoặc huỳnh quang. Test kháng nguyên trong máu đánh giá bằng số lƣợng tế bào lympho trình diện kháng nguyên pp55 bề mặt tế bào lympho Tc, giúp các tế bào này nhận biết và tiêu diệt tế bào bị nhiễm.
Kháng nguyên trong máu đƣợc xác định khi phát hiện đƣợc kháng nguyên CMV pp65 trong bạch cầu.
Thử nghiệm pp65 dùng phát hiện thông tin protein cơ chất trên vi rút CMV, hoặc làm kỹ thuật IFA hoặc khuếch đại chuỗi ARN thông tin. Các loại protein này chỉ trình diện trong quá trình sao chép vi rút.
Thử nghiệm kháng nguyên thƣờng là các xét nghiệm cơ bản của các viện trong vấn đề trị liệu thuốc chống vi rút ở các đối tƣợng ghép tạng và có thể cho phép phát hiện bệnh lý ẩn lâm sàng trên nhóm bệnh nhân có nguy cơ cao. Thử nghiệm có độ nhạy và đặc hiệu lại cho kết quả nhanh.
Thử nghiệm kháng nguyên không thể sử dụng trên các bệnh nhân có giảm bạch cầu, vì các test này phát hiện kháng nguyên trong bạch cầu trung tính;
Trên những bệnh nhân suy giảm miễn dịch, kháng nguyên trong máu CMV mức độ nhẹ hoặc trung bình có thể chỉ ra sự tái hoạt hoặc nhiễm trùng CMV.
Ngƣời ta đã báo cáo thử nghiệm kháng nguyên pp65 và phƣơng pháp CMV PCR định lƣợng (COBAS Amplicor Monitor Test) có hiệu quả trong chẩn đoán và giám sát các bệnh nhân nhiễm CMV tái hoạt động [28], [125].
+ Nhiễm nhẹ: 1-10/200.000 bạch cầu không có triệu chứng + Nhiễm vừa: 10-49/200.000 bạch cầu có triệu chứng + Nhiễm nặng: > 50/200.000 bạch cầu
Xác định ADN của vi rút trong bệnh phẩm bằng phản ứng khuếch đại chuỗi gen PCR.
Phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR) [3], [11]: PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn ADN mà không cần sử dụng các sinh vật sống nhƣ E.coli hay nấm men. PCR CMV hiện nay là phƣơng pháp có giá trị nhất trong chẩn đoán nhiễm CMV. Demmler GJ nghiên cứu thấy PCR-CMV trong nƣớc tiểu và máu tƣơng đƣơng nhau có độ nhạy là 93% và độ đặc hiệu là 100% khi chẩn đoán nhiễm CMV bẩm sinh [70]. PCR-CMV đƣợc thực hiện trên phƣơng pháp Real-time PCR, tùy theo phƣơng pháp chạy, kết quả có thể cho ta biết trong mẫu bệnh phẩm có ADN của CMV không (định tính) hoặc có bao nhiêu phân tử ADN- CMV trong mẫu đó (định lƣợng), tuy nhiên giá trị này là bao nhiêu thì có biểu hiện lâm sàng hiện nay vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu kỹ. PCR-CMV sẽ cho kết quả dƣơng tính khi có >100 bản sao/ml plasma [157].
PCR định tính (Qualitative PCR) đƣợc dùng để phát hiện CMV trong máu và các mẫu bệnh phẩm là mô;
PCR lệ thuộc vào quá trình sao chép các cặp mồi đặc hiệu cho vị trí gen CMV. Các cặp mồi thƣờng gắn với vùng của vi rút mã hóa cho các kháng nguyên sớm;
PCR định tính nhạy và có thể phát hiện AND của vi rút CMV trên bệnh nhân có hay không bệnh hoạt động nhƣng theo dõi dọc bệnh nhân lại có giá trị.
Kết quả âm tính chỉ ra các bệnh nhân không có vi rút CMVtrong máu; Trên những bệnh nhân ghép tạng, kết quả PCR âm tính cho biết sự tái hoạt nhƣng không nhiễm trùng.
-Xét nghiệm PCR định lƣợng (Quantitative polymerase chain reaction) PCR định lƣợng (Quantitative PCR) đã đƣợc dùng để phát hiện CMV trong huyết tƣơng. Lợi điểm của PCR định lƣợng hơn hẳn PCR thƣờng. PCR định lƣợng có độ nhạy nhƣ PCR định tính ngoài ra còn cung cấp ƣớc tính số gen nhiễm hiện diện trong huyết tƣơng;
Một nghiên cứu hơn 3400 mẫu máu từ các bệnh nhân ghép tạng bằng xét nghiệm PCR và thử nghiệm kháng nguyên pp65 trong máu thấy rằng RT- PCR có thể dùng thay thế cho định lƣợng kháng nguyên trong máu trong việc giám sát nhiễm CMV và xác định khi điều trị ƣu tiên;
Về mặt lý thuyết, lƣợng vi rút CMV sẽ chỉ ra liệu trình trị liệu cần thiết vì các bệnh nhân có lƣợng vi rút thấp dƣới 5000 bản sao/ml sẽ không phát triển thành bệnh CMV. Tuy nhiên, mức độ vi rút trong máu cần thiết xác định bệnh xảy ra có thể khác nhau tùy thuộc vào các yếu tố vật chủ và loại tạng ghép, và điều này cần xác định một cách thận trọng. Chẳng hạn, trên những viêm võng mạc do CMV, lƣợng vi rút có giá trị tiên đoán dƣơng kém, có nghĩa là tính thống nhất về lâm sàng kém.
Xét nghiệm PCR gồm có COBAS Amplicor CMV Monitor test (chỉ dùng trong nghiên cứu tại la bô), và Hybrid Capture System CMV AND test dùng định lƣợng, qualitative Hybrid Capture test (FDA chấp nhận). Vì lƣợng vi rút không thể so sánh trong số các thử nghiệm khác nhau, điều quan trọng là sử dụng các thử nghiệm giống nhau trên cùng loại mẫu bệnh phẩm (máu hoặc huyết tƣơng) khi giám sát bệnh nhân theo thời gian theo dõi.
Thử nghiệm trong vỏ (Shell vial assay)
Thử nghiệm trong vỏ (SVA) đƣợc thực hiện bằng cách thêm các mẫu bệnh phẩm lâm sàng vào trong một lọ nhỏ chứa các dòng tế bào cho phép với
CMV. Các lọ này đƣợc đem ly tâm tốc độ thấp và đặt vào trong tủ ấm. Sau 24 và 48 giờ, môi trƣờng nuôi cấy mô bị loại khỏi và lấy các tế bào nhuộm sử dụng chất.
Đánh dấu huỳnh quang kháng thể chống CMV
Các tế bào này đọc thông qua kính hiển vi huỳnh quang. Cũng có thể các tế bào nhuộm với kháng thể chống lại CMV, theo đó bởi một loại Ig miễn dịch đánh dấu huỳnh quang.
1.2.3.2 Chẩn đoán huyết thanh học
Nhiều kỹ thuật huyết thanh học dùng để xác định kháng thể kháng CMV trong huyết thanh bệnh nhân. Kháng thể IgM đƣợc xác định bằng miễn dịch liên kết enzyme hoặc miễn dịch huỳnh quang; kháng thể IgG xác định bằng kỹ thuật ELISA hoặc thử nghiệm ngƣng kết hồng cầu thụ động. Nồng độ kháng thể IgM thƣờng đƣợc tạo ra sớm sau nhiễm vi rút, IgM tăng hoặc có tăng gấp 4 lần nồng độ và hiệu giá kháng thể IgG trên các bệnh nhân có nhiễm CMV gần đây. IgM có thể tồn tại trong thời gian từ 1-3 tháng.. Kết quả CMV IgM dƣơng tính giả có thể nhìn thấy trên các bệnh nhân nhiễm EBV hoặc HHV-6, cũng nhƣ trên các bệnh nhân có nồng độ yếu tố thấp (RF) cao.
Một số thử nghiệm nhạy đủ để phát hiện kháng thể kháng CMV IgM sớm trong giai đoạn đầu của bệnh (kháng nguyên nhân CMV sớm, kháng nguyên CMV virus capsid) và trong khi có sự tái hoạt của CMV [17], [23], [28], [37].
1.2.4. Chẩn đoán xác định
CMV đã đƣợc phát hiện trên nuôi cấy (nguyên bào sợi ở ngƣời) bằng kỹ thuật phát hiện kháng thể, kháng nguyên, phát hiện vật liệu di truyền của vi rút và phân tích tế bào học.
1.2.5. Chẩn đoán phân biệt - Viêm phổi do vi khuẩn - Viêm phổi do vi khuẩn
- Viêm phổi do nấm
- Viêm phổi do Mycobacteria
- Viêm phổi do P. carinii...
1.2.6. Điều trị
1.2.6.1. Thuốc kháng vi rút
Ganciclovir:
- Cấu trúc hóa học:
Systematic (IUPAC) name
2-[(2-amino-6-oxo-6,9-dihydro-3H-purin-9-yl)methoxy]-3-hydroxypropyl (2S)-2-amino-3-methylbutanoate
-Cơ chế tác dụng:
Ganciclovir là một nucleosid tổng hợp tƣơng tự guanin có cấu trúc giống aciclovir, có tác dụng chống CMV. Ðể có tác dụng, Ganciclovir phải đƣợc phosphoryl hóa bởi deoxyguanosin kinase trong tế bào nhiễm CMV thành dạng ganciclovir monophosphat, sau đó chuyển tiếp thành dạng diphosphat và dạng hoạt động triphosphat. Nồng độ ganciclovir triphosphat có thể nhiều gấp 100 lần ở tế bào nhiễm CMV so với tế bào không bị nhiễm, chứng tỏ phosphoryl hóa ƣa xảy ra trong tế bào nhiễm vi rút. Ganciclovir triphosphat ức chế tổng hợp ADN của vi rút bằng cách ức chế polymerase ADN và cũng sát nhập cả vào ADN của vi rút. Quá trình này xảy ra một cách chọn lọc trong các tế bào nhiễm vi rút.
-Dƣợc động học
Khả dụng sinh học của ganciclovir từ 6% đến 9% khi uống trong bữa ăn, và từ 28 tới 31% nếu bữa ăn có nhiều chất béo. Nồng độ thuốc trong huyết tƣơng cao nhất sau khi tiêm truyền trong 1 giờ với liều 5 mg/kg trung bình là 32 micromol/lít; 11 giờ sau khi tiêm, nồng độ trong huyết tƣơng giảm xuống còn khoảng 2 micromol/lít. Nồng độ của ganciclovir trong dịch não tủy biến thiên trong khoảng 7 - 70% nồng độ trong huyết tƣơng. Liên kết với protein từ 1 đến 2%. Nửa đời thải trừ là 2 - 6 giờ, với độ thanh thải là 3 - 4 ml/phút/kg ở ngƣời bệnh có chức năng thận bình thƣờng. Thuốc thải trừ chủ yếu qua thận, phần lớn thải trừ ở dạng không đổi trong nƣớc tiểu (94 - 99%). Ở ngƣời bệnh có chức năng thận giảm, phải điều chỉnh liều.
-Tác dụng phụ:
Tác dụng phụ quan trọng nhất của Ganciclovir gồm có sốt, phát ban, tiêu chảy, xuất huyết, giảm bạch cầu, thiếu máu và giảm tiểu cầu. Giảm bạch cầu đƣợc kiểm soát thông qua giảm liều và hoặc thêm các yếu tố phát triển (nhƣ granulocyte colony-stimulating factor [G-CSF], granulocyte-macrophage colony-stimulating factor [GM-CSF]). Do đó khuyến cáo khi sử dụng: Không nên bắt đầu điều trị nếu số lƣợng bạch cầu trung tính dƣới 500 tế bào/μl hoặc Hb dƣới 8 g/dl.
-Lƣu ý:
Khi dùng Gancilcovir: không trộn Cymevene với các thuốc tiêm khác. Không dùng Cymevene với Tienam vì tăng nguy cơ co giật. Bệnh nhân cần đƣợc cách ly tƣơng đối với các bệnh nhân khác và theo dõi sát phát hiện sớm các biến chứng và tác dụng phụ có thể gặp.
Dùng Ganciclovir đƣờng uống có nồng độ trong huyết thanh thấp hơn gấp 5-10 lần dùng tĩnh mạch Ganciclovir. Valganciclovir hydrochloride, một phiên bản đƣờng uống của (L-valyl ester) Ganciclovir, đã đƣợc chấp nhận dùng điều trị viêm võng mạc mắt doCMV trên các bệnh nhân nhiễm HIV;
Trong điều trị VP do CMV, Ganciclovir đƣợc chỉ định cùng với globulin miễn dịch đặc hiệu CMV. Tuy nhiên, ngƣời ta vẫn chƣa biết Ganciclovir hỗ trợ về mặt miễn dịch nhƣ thế nào với globulin miễn dịch. Vì thế, nó dẫn đến hiệu quả tốt hơn trong điều trị VP do CMV.
Thời gian trị liệu có khác nhau. Một số thầy thuốc lâm sàng có chỉ định dùng Ganciclovir dài đến 2-4 tuần, lệ thuộc vào tình trạng lâm sàng của bệnh nhân. Gần đây, các nhà nghiên cứu đã nghiên cứu liệu trình dùng ngắn hơn liệu pháp Ganciclovir đƣờng tĩnh mạch trong điều trị nhiễm hoặc bệnh do CMV. Nếu hiệu quả, điều này có thể giúp cải thiện chất lƣợng sống cho bệnh nhân để giảm thời gian nằm viện.
Sự đề kháng với thuốc Ganciclovir rất ít gặp. Tháng 8/2000 Limaye và cộng sự ở đại học Washing Seat báo cáo trên tạp trí The Lancet về trƣờng hợp kháng Ganciclovir của CMV trên bệnh nhân ghép tạng mà trƣớc đó chƣa có ca nào đƣợc ghi nhận, điều này mở ra một thách thức lớn với việc điều trị CMV. Nguyên nhân kháng là do có sự đột biến gen UL97 (phosphor- transrase) và gen UL54 (ADN polymerase. Đề kháng gặp invivo đối với Ganciclovir là do thiếu phosphoryl hóa, vì thuốc này có khả năng ức chế ADN polimerase của CMV.
Thuốc kháng vi rút khác
Ngoài ra còn có một số thuốc khác nhƣ: Foscarnet, Cidofovir… Foscarnet có thể gây độc với thận và nên dùng khi có kháng Ganvciclovir. Cidofovir cũng độc với thận, vì vậy cần kết hợp với probenecid. Năm 2008, trên tạp chí Clinical Infectious Diseases có bài báo cáo về việc sử dụng Artesunate để điều trị nhiễm CMV ở một bệnh nhân đƣợc ghép tế bào gốc sau khi đã đƣợc xác định là có đề kháng Foscarnet và Ganciclovir. Điều trị có kết quả 1.7-2.1 log vi rút trong cho thấy thuốc có hiệu quả cao trong việc ức chế sự nhân lên của vi rút.
Hiện nay đang có nhiều nghiên cứu về Ig cƣờng miễn dịch CMV (Cytogam), Valacyclovir và Valganciclovir. Vaccin sử dụng một tiểu đơn vị gB, một chất ức chế chọn lọc furin với một gần giống alpha1-antitrysin có tên gọi alpha1- PDX, phá vỡ vỏ protein của CMV cũng đang đƣợc nghiên cứu.
Ở trẻ sơ sinh, kinh nghiệm điều trị CMV chƣa nhiều, theo quan điểm
hiện nay chỉ điều trị nhiễm CMV khi có biểu hiện lâm sàng nặng. Thuốc
cần sử dụng trƣớc tiên trong mọi trƣờng hợp là Ganciclovir, vì thuốc này điều trị đặc hiệu các tế bào nhiễm CMV có chứa phosphokinase, một sản phẩm của gen YL97 CMV. Protein này có khả năng phosphoryl hóa Ganciclovir thành một nửa có hoạt tính chống CMV, EBV. Đây là điều quan trọng vì các thƣơng tổn của HSV thƣờng kèm theo sự tái hoạt tính của CMV và EBV. Việc điều trị tổn thƣơng gan và viêm võng mạc đạt kết quả cao hơn khi có viêm phổi.
Foscarnet (natri phosphonofomat) cũng có vai trò chống lại nhiễm vi rút CMV bằng cách ức chế ADN polymerase của vi rút.
Cidifovir là chất tƣơng tự nucleotid có thời gian bán hủy trong tế bào dài hơn cho phép tiêm tĩnh mạch từng đợt.
Điều trị hỗ trợ khác:
Thở oxy, nuôi dƣỡng và chăm sóc. Đồng thời bệnh nhân đƣợc theo dõi sát các dấu hiệu nhiễm trùng để bổ xung điều trị kháng sinh cho phù hợp [34], [42], [50], [198].
* Phác đồ dùng thuốc kháng vi rút trong điều trị nhiễm và bệnh lý do CMV [69], [57]:
Điều trị Liều lƣợng Khoảng cách Đƣờng dùng Thời gian
Ganciclvir
Tấn công 5 mg/kg 12 giờ TM 2-3 tuần
Duy trì Bẩm sinh 5 mg/kg 6 mg/kg 24 giờ (3-N/tuần) 12 giờ TM / Uống TM Không giới hạn 6 tuần Valganciclovir
Tấn công 900 mg 12 giờ TM 2 tuần
Duy trì 900 mg 24 giờ TM Không giới hạn
Bẩm sinh Đang nghiên cứu
Foscarnet
Tấn công 60 mg/kg 8 giờ TM 2-3 tuần
Duy trì 90-120 mg/kg 24 giờ TM Không giới hạn
Bẩm sinh Không khuyến cáo
Cidofovir Tấn công 5 mg/kg 1 mg/kg 7 ngày 3 ngày TM 2 tuần (2 liều) 2 tuần (6-8 liều)
Duy trì 5 mg/kg 14 ngày TM 10 tuần (5 liều)
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.3.1. Nƣớc ngoài 1.3.1. Nƣớc ngoài
Kể từ khi phát hiện ra vi rút CMV năm 1881. Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu liên quan đến VP do nhiễm CMV. Các nghiên cứu về tỷ lệ mắc, đặc điểm dịch tễ của bệnh đƣợc nhiều tác giả quan tâm nhƣng chủ yếu tập chung vào nhóm bệnh nhân SGMD.
Năm 1985 Cohen nghiên cứu nhiễm CMV ở bệnh nhân thƣờng [57]. Năm 1998 Demmler GL và cộng sự nghiên cứu sự phát hiện ADN của CMV trong nƣớc tiểu bệnh nhân bằng phƣơng pháp PCR [69].
Năm 1998 Avila - Aguero ML nghiên cứu tác dụng của Ganciclovir lên bệnh nhân suy giảm miễn dịch bị nhiễm CMV [33].
Các nghiên cứu huyết thanh học đƣợc tiến hành trên toàn cầu chứng minh CMV là nhiễm trùng phổ biến của loài ngƣời. Tùy thuộc vào số lƣợng dân số đƣợc thăm dò, CMV chúng ta có thể xác định đƣợc 40 - 100% tùy thuộc vào điều kiện kinh tế - xã hội. Nhiễm trùng sớm hơn trong cuộc đời