M: Marker1kb; 1 sản phẩm cắt bằn g2 enzyme giới hạn XhoI và XbaI; 2 Đối chứng là gen keratinase; 3: Đối chứng là vector pJET1
3.4.3. Thiết kế vector biểu hiện trong Bacillus subtilis
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng vector pHT43 làm vector biểu hiện trong hệ biểu hiện B.subtilis. Vector pHT43 thuộc dòng vector pHT đã được thương
mại hóa bởi công ty Mobitec (Đức) [48], đây là vector con thoi, có thể cùng lúc biểu hiện trong cả hệ biểu hiện ở Bacillus và E.coli. Dòng vector pHT có chứa operon groESL nằm trong vùng lac operator cho phép cảm ứng kích thích sinh tổng hợp protein ngoại lai bằng cách bổ sung IPTG. Hàm lượng enzyme tái tổ hợp được sinh tổng hợp sau khi được cảm ứng bằng IPTG có thể tăng lên từ lần lượt từ 10- 13% trong protein tổng số khi thử nghiệm biểu hiện gen mã hóa htpG và pbpE. Đồng thời, protein tái tổ hợp của gen amyQ α-amylase và cellulase A, B từ chủng
Clostridium thermocellum cũng được thử nghiệm và cho kết quả rất tốt với vector
pHT43 . Bên cạnh đó, gen mã hóa enzyme α-amylase này đã được chứng minh có khả năng biểu hiện rất tốt trong vector pHT43 sinh tổng hợp enzyme tái tổ hợp có hoạt tính sinh học cao. Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã quyết định tái tổ hợp gen KerB với promoter của gen mã hóa α-amylas từ chủng chủ Bacillus subtilis 168M để đảm bảo quá trình dịch mã sinh tổng hợp enzyme diễn ra chính xác và đạt hiệu quả cao nhất.
Đoạn gen ngoại lai [Bspr.KerB] được cắt bằng hai enzyme SmaI và KpnI từ vector pTZ57R/T và gắn vào vector pHT43 đã mở vòng ở hai điểm cắt tương ứng bằng T4 ligase trước khi biến nạp vào tế bào E. coli TOP10F’ để nhân dòng.
Các dòng tế bào E.coli Top10F được nuôi trên môi trường có bổ sung kháng sinh chọn lọc để thu nhận tách chiết plasmid. Plasmid sau khi lựa chọn được tách chiết sẽ cắt kiểm tra đoạn DNA ngoại lai bằng hai enzyme giới hạn tương ứng là
SmaI và KpnI. Kết quả cắt kiểm tra plasmid tách chiết được thể hiện ở hình 17
Hình 178. Plasmid pHT43 mang tổ hợp mang [Bspr.KerB] được cerB] được 43SmaI và KpnI. 1: Plasmid pHT43 mang tổ hợp [Bspr.Ker] đã cắt bằng SmaI và KpnI. 2: Plasmid pHT43 không mang tổ hợp [Bspr.Ker]. M: Marker 1kb (NEB)
Kết quả trên hình cho thấy plasmid tách chiết sau được cắt bằng enzyme giới hạn xuất hiện hai băng DNA, 1 băng có kích thước khoảng 8000 bp bằng đúng kích thước vector pHT43, 1 băng có kích thước khoảng 1100 bp bằng đúng kích thước đoạn gen ngoại lai [Bspr.KerB]. Trong khi đó, mẫu đối chứng là vector pHT43 không mang gen ngoại lai, sau khi được cắt bằng enzyme giới hạn chỉ xuất hiện một băng duy nhất có kích thước đúng bằng khoảng 8000 bp . Điều này khẳng định chúng tôi đã thiết kế thành công vector tái tổ hợp pHT43. Các plasmid pHT43 mang đoạn gen tái tổ hợp [Bspr.KerB] với kích thước khoảng 1,1 kb sẽ được thu nhận để tiến hành biến nạp vào tế bào trần B. subtilis 168M.