M: Marker1kb; 1 sản phẩm cắt bằn g2 enzyme giới hạn XhoI và XbaI; 2 Đối chứng là gen keratinase; 3: Đối chứng là vector pJET1
3.3.2. Kết quả phân tích trình tự gen
Các plasmid mang đoạn gen ngoại lai được kiểm tra bằng giải trình tự gen. Trình tự gen KerE được đọc bằng mồi của vector và phân tích trên phần mềm BioEdit, thu được kết quả như hình 12.
ggatccaaaaaattgtggatcagcttgttgtttgcgttaacgttaatctttacgatggcg ttcagcaacatgtctgcgcaggctgccggaaaaagcagtacagaaaagaaatacattgtc ggatttaagcagacaatgagtgccatgagttccgccaagaaaaaggatgttatttctgaa aaaggcggaaaggttcaaaagcaatttaagtatgttaacgcggccgcagcaacattggat gaaaaagctgtaaaagaattgaaaaaagatccgagcgttgcatatgtggaagaagatcat attgcacatgaatatgcgcaatctgttccttatggcatttctcaaattaaagcgccggct cttcactctcaaggctacacaggctctaacgtaaaagtagctgttattgacagcggaatt gactcttctcatcctgacttaaacgtcagaggcggagcaagcttcgtaccttctgaaaca aacccataccaggacggcagttctcacggtacgcatgtagccggtacgattgccgctctt aataactcaatcggtgttctgggcgtagcgccaagcgcatcattatatgcagtaaaagtg cttgattcaacaggaagcggccaatatagctggattattaacggcattgagtgggccatt tccaacaatatggatgttatcaacatgagccttggcggacctactggttctacagcgctg aaaacagtcgttgacaaagccgtttccagcggtatcgtcgttgctgccgctgccggaaac gaaggttcgtccggaagctcaagcacagtcggctaccctgcaaaatatccttctactatt gcggtaggtgcggtaaacagcagcaaccaaagagcttcattctcaagcgcaggttctgag cttgatgtgatggctcctggcgtatccatccaaagcacacttcctggaggcacttacggt gcttacaacggcacgtccatggcgactcctcacgttgccggagcagcagcgctaattctt tctaagcacccgacttggacaaacgcgcaagtccgtgatcgtttagaaagcactgcaaca tatcttggaaactctttctactatggaaaagggttaatcaacgtacaagcagctcgagca ccaccaccaccaccactgagatccggctgctaacaaagccccgaaacggagggctg Hình 12. Trình tcaccaccactgagatccggctgctaacaaagccccgaaacggagggctgaacator)
Trình tự gen ker được so sánh với các trình tự gen ker từ các chủng Bacillus sp khác đã công bố trên Genbank. Kết quả cho thấy gen ker có độ tương đồng 99% với gen kerC của chủng B. subtilis YYW-1 có mã số truy cập EU362730.1. Từ các kết quả so sánh về trình tự nucleotit, và trình tự axit amin có thể cho thấy gen ker chúng tôi phân lập được từ chủng ĐNđ1.2 là gen mã hóa cho keratinase. Do vậy, có thể sử dụng gen tạo ra chủng tái tổ hợp có khả năng sinh enzyme này cao.
3.3.3.Thiết kế vector biểu hiện trong E.coli
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng vector biểu hiện trong E.coli là pET32a. Theo lý thuyết, vector pET 32a có promoter lai T7/lac[42], vị trí đa nhân dòng (multiple cloning site), và trình tự kết thúc T7. Việc phiên mã từ promoter lai T7/lac đòi hỏi phải có T7 RNA polymerase. Tế bào E. coli chủ có gen mã hóa cho T7 RNA polymerase được đưa vào nhiễm sắc thể bằng công nghệ gen, nhưng protein kìm hãm lac operon, lacI, ức chế biểu hiện gen này. Khi IPTG được thêm vào, nó cảm ứng việc giải phóng lacI ra khỏi operator của lac operon và quá trình phiên mã được bắt đầu. T7 RNA polymerase sau đó được tạo ra và bám vào promoter lai T7/lac, và protein tái tổ hợp được sản xuất.
Gen KerE được thu từ vector tách dòng bằng cách thôi gel sản phẩm cắt enzyme giới hạn pJET1.2 –KerE (GenJETTM Genomic DNA purification Kit). Để đưa được gen Ker vào vector biểu hiện, trước tiên phải xử lý cắt mở vòng vector pET32a với 2 enzyme XhoI và BamHI. Sau đó sản phẩm gen ker tinh sạch được nối vào vector pET32a đã được cắt mở vòng.
Trong vector biểu hiện này, vùng nhân bản có sẵn điểm His•Tag® và S•Tag™ phục vụ cho việc nhận biết và tinh sạch các protein. Sản phẩm lai được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21 trên môi trường đã được bổ sung các kháng sinh chọn lọc. Để kiểm tra sản phẩm của phản ứng nối, chúng tôi tiếp tục tách plasmid và chọn lựa những dòng tế bào có kích thước plasmid lớn hơn pET32a. Xử lý đồng thời các dòng plasmid này với enzyme giới hạn tương ứng và điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose thu được kết quả như Hình 14.13.
Hình 13.Cình 1ược kết quả như điện di kiểm trenzyme czymeược kết 1 Thang DNA chuuả 2: Ker-pET32 đưuả như điện di kiểm BamHI
Kết quả trên bảng điện di (hình 13) cho thấy, vector Ker-pET32a được xử lý bằng cắt XhoI và BamHI tạo ra 2 băng, băng thứ nhất là có kích thước khoảng 5,9 kb đúng bằng kích thước của vector pET32, băng thứ 2 có kích thước khoảng 1,2 kb là kích thước của gen Ker. Kết quả này khẳng định chúng tôi đã thiết kế và biến nạp thành công vector biểu hiện KerE-pET32a vào trong chủng E.coli BL21.