3.1. Kết quả tách DNA tổng số
ADN tổng số chủng vi khuẩn tuyển chọn được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp của Masterson và cộng sự [32]. Sản phẩm sau đó được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
Hình 9. Ảnh điện di DNA tổng số. Giếng 1,2: D.Nd1.2, Giếng M: marker
Sau khi tách chiết DNA chúng tôi tiến hành đo quang phổ, thu được kết quả như sau : OD260= 0.025 , OD280= 0.0133. Nồng độ DNA: Cng/µl= 0.025 x 50 x 100 = 125.
Kết quả điện di đồ trên hình 9 và kết quả đo quang phổ cho thấy DNA tổng số của chủng Bacillus subtilis đã được thu nhận thể hiện độsau khi tách chiết cố độ tinh sạch cao, không bị đứt gãy y,, RNA đã loại bỏ được hoàn toàn. Như vậy, sản phẩm DNA tổng số đảm bảo yêu cầu chất lượng để làm khuôn cho phản ứng PCR.
3.2. Nhân gen keratinase bằng PCR
Hai phản ứng PCR được tiến hành độc lập cho mỗi cặp mồi đặc hiệu là KerE và KerB. Tất cả các thành phần và chu trình của phản ứng PCR được tính toán sao cho nồng độ gen thu được tối ưu nhất, tránh xuất hiện các đoạn băng phụ và các thành phần bị dư. Số chu kì trong một phản ứng PCR thường là 25 – 35, tùy thuộc
vào lượng bản mẫu ban đầu. Số chu kì thường không vượt quá 40 vì lúc đó hiệu quả khuếch đại bị giảm do cạn kiệt các thành phần của phản ứng hoặc có thể xuất hiện các sản phẩm phụ, ức chế phản ứng. Trong nghiên cứu này, với lượng DNA khuôn mẫu đưa vào là 50 ng DNA tổng số, 30 chu kì PCR được thiết lập như đã nêu ở phần 2.2.2.
Tính chính xác và hiệu suất của enzyme DNA polymerase phụ thuộc nhiều vào hệ buffer sử dụng. Một thành phần quan trọng trong hệ đệm là Mg2+. Thành phần này giúp tạo phức với dNTP, cần thiết để gắn dNTP vào enzyme, kích thích hoạt tính của polymerase. Nồng độ Mg2+ cao làm các DNA không biến tính hoàn toàn, sản phẩm bị ít đi. Tuy nhiên nồng độ Mg2+ ít lại làm xấu quá trình kéo dài chuỗi DNA mới. Với DNA polymerase của hãng Dream Taq, Mg2+ đã đượng được bổ sung vào dung dịch buffer với nồng độ tối ưu, phù hợp với DNA polymerase. Kết thúc chu trình nhiệt, sản phẩm PCR của gen nhân bởi 2 cặp mồi này được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% như (hình 10).
Hình 10. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen Keratinase.