M: Marker1kb; 1 sản phẩm cắt bằn g2 enzyme giới hạn XhoI và XbaI; 2 Đối chứng là gen keratinase; 3: Đối chứng là vector pJET1
3.4.1 Tái tổ hợp gen KerB bằng phương pháp Megaprimer
Để biểu hiện thành công gen KerB thì khoảng cách từ promoter đến codon khởi đầu của khung đọc mở phải đảm bảo việc dịch mã không được đứt quãng. Do đó chúng tôi tái tổ hợp gen KerB với Promoter của gen α-amylase từ
chính chủng B. subtilis bằng phương pháp Mageprimer như hình 8 phần 2.2.9. Promoter của gen α-amylase từ chính chủng B. subtilis chọn làm chủng chủ (BsA), tạo ra sự phù hợp cao giữa RNA-polymerase của chủng chủ với promoter của hệ biểu hiện. Quá trình khuếch đại các đoạn promoter của BsA, KerB của Bacillus sp và tái tổ hợp hai đoạn gen trên thông qua 3 PCR liên tiếp: PCR1a, PCR1b, PCR2. Trong đó sản phẩm PCR1a là đoạn promoter nhân lên từ chủng B.subtilis 168M bằng cặp mồi P1Bs và Pk. Sản phẩm PCR1b là gen Ker nhân lên bởi cặp mồi KerB. Sử dụng sản phẩm PCR1a và sản phẩm phản ứng khuếch đại gen KerB tiến hành phản ứng PCR2. Đây là dạng phản ứng PCR kéo dài, sử dụng cặp mồi P1Bs và KerB-R, 2 khuôn DNA song song là đoạn promoter Bspr và đoạn gen KerB. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR2 được thể hiện trong bảng 6.
Sản phẩm của các phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% và thu được kết quả như Hình 15.
Hình 15 : Điện di đồ sản phẩm PCR. M: Marker DNA chuẩn 1 kb, 1: Sản phẩm PCR2, 2: Sản phẩm PCR1a, 3: Sản phẩm PCR1b
Hình ảnh điện di cho thấy kích thước đoạn DNA tổ hợp giữa gen kerB và promoter của chủng B.subtilis 168M [Bsp.KerB] có kích thước đúng bằng tổng kích thước của hai gen nhân bởi PCR1a và PCR1b và đúng với kích thước tính toán, các
sản phẩm PCR rõ ràng, không bị đứt gãy, đặc hiệu. Như vậy sản phẩm PCR2 hoàn toàn đủ tiêu chuẩn để sử dụng cho các bước nghiên cứu tiếp theo.
3.4.2. Tách dòng tổ hợp gen keratinase bằng vector pTZ57RT trong E.coli
TOP10F’
Tổ hợp gen Bsp.KerB sau khi được khuếch đại bằng PCR2 sẽ được gắn với vector pTZ57R/T và nhân dòng trong E. coli TOP10F’. Các plasmid thu nhận sau khi tách chiết sẽ được cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn KpnI và SmaI để kiểm
tra khả năng gắn của tổ hợp gen với vector. Kết quả cắt kiểm tra plasmid bằng 2 enzyme giới hạn được thể hiện trên hình 16.
Hình 16: Điện di đồ sản phẩm cắt kiểm tra vector tách dòng bằng enzyme giới hạn. 1: Vector pTZ57RT[Bsp.Ker], 2: Vector pTZ57RT, M: Marker DNA chuẩn
1kb
Kết quả trên băng điện di cho thấy sản phẩm cắt có 2 băng khác nhau, theo đúng lý thuyết. Băng thứ nhất có kích thước gần 3kb tương đương với kích thước của vector pZT57R/T, băng thứ 2 khoảng 1100 bp, tương đương với kích thước của gen ngoại lai [Bsp.KerB]. Điều này chứng tỏ, chúng tôi đã tách dòng thành công gen ngoại lai [Bsp.KerB] trong vector tách dòng pZT57R/T.