M: Marker1kb; 1 sản phẩm cắt bằn g2 enzyme giới hạn XhoI và XbaI; 2 Đối chứng là gen keratinase; 3: Đối chứng là vector pJET1
3.5.Xác định hoạt tính keratinase tái tổ hợp từ E.coli BL21 và B.subtilis 168M
Do tính chất của chủng E.coli là tiết enzyme nội bào, do đó muốn thu nhận keratinase tái tổ hợp, chủng E.coli BL21 cần được siêu âm phá vỡ tế bào để thu nhận enzyme nội bào. Ngược lại, chủng B.subtilis 168M lại có tính chất tiết enzyme ngoại bào ra môi trường nên việc thu nhân enzyme sẽ dễ dàng hơn nhiều thông qua quá trình ly tâm thu dịch nổi. Kết quả đo hoạt tính của các vi khuẩn tái tổ hợp và các mẫu vi khuẩn đối chứng thể hiện qua bảng.
Bảng 7. Hoạt tính của enzyme keratinase từ các chủng nghiên cứu
Loại cơ chất
Hoạt tính keratinase (U/ml)
E. coli BL21(DE3) [pET32(+)-ker] B.subtilis 168M pHT43[Bspr.Ker ] Chủng hoang dại Azokeratin 21 688,5 275
Kết quả (bảng 7) cho thấy chủng B.subtilis 168M tái tổ hợp có hoạt tính cao hơn rất nhiều so với hoạt tính keratinase tái tổ hợp từ chủng E.coli và so với mẫu đối chứng. Hoạt tính keratinase tái tổ hợp từ chủng E.coli là thấp nhất, thấp hơn cả so với chủng hoang dại. Gen mã hóa cho keratinase được tổng hợp từ chủng
B.subtilis 168M là một dạng preprosubtilisin điển hình, trong đó propeptid hoạt
động như một chaperone nội phân tử trong quá trình cuộn xoắn để hình thành lên cấu trúc có hoạt tính của subtilisin, sau đó chúng sẽ được cắt bỏ khỏi phân tử subtilisin, khi biểu hiện trong E. coli nếu propeptid không được biểu hiện cùng sẽ dẫn đến hoạt tính sẽ không có. Ngoài ra, khi biểu hiện trong E. coli, các protein sinh ra có xu hướng tạo thành dạng thể vùi không hòa tan, do E. coli không có khả năng thực hiện các biến đổi sau dịch mã, do vậy các protein sau khi được tổng hợp phải trải qua những biến đổi sau dịch mã cuộn gấp để tạo thành cấu trúc bậc ba và bốn, nhưng các chaperone này không có trong E. coli hoặc có nhưng không đầy đủ các chaperon giống như quá trình tổng hợp trong Bacillus. Do không có đầy đủ các chaperon dẫn đến sự sai sót trong quá trình cắt bỏ phần prepropeptid, hoặc không
hình thành đầy đủ các cấu trúc gấp nếp của enzyme, kết quả là protein sẽ được hình thành ở dạng keo tụ và dạng hòa tan, chúng thường không có hoạt tính hoặc hoạt tính thấp. Còn ở chủng tái tổ hợp B. subtilis 168M mang vector pHT43[Bspr.ker] promoter được sử dụng là promoter của gen α-amylase của chính chủng chủ. Khi
promoter này ở nhiễm sắc thể sẽ được cảm ứng bằng tinh bột, nhưng trong trường hợp này nó nằm ngoài nhân trên plasmid nên không cần đến tinh bột để cảm ứng, mà quá trình điều hòa biểu hiện phụ thuộc hoàn toàn vào quá trình sinh trưởng của chủng tái tổ hợp, trong đó glucose vừa đóng vai trò là cơ chất vừa là yếu tố giới hạn nên ảnh hưởng nhiều nhất đến quá trình biểu hiện gen. Kết quả từ bảng 7 cho thấy hoạt độ keratinase từ chủng tái tổ hợp B. subtilis 168M mang vector pHT43[Bspr.ker] (688,5 U/mL) cao hơn so với keratinase từ chủng dại Bacillus sp DNd 1.2 (275 U/mL) 2,5 lần. Kết quả này tương tự với kết quả của Nguyễn Văn Hiếu và cộng sự (2010) [1] khi tái tổ hợp gen keratinase của chủng B. licheniformis DS23 vào vector pHT43 và biểu hiện trong tế bào B. subtilis 168 đã làm tăng hoạt tính enzyme lên 3,5 lần từ 21,6 U/mL lên 75,8 U/mL [1]. Liu và cộng sự cũng thu nhận keratinase kiềm chống oxi hóa với hoạt độ 323 U/mL từ chủng B.
licheniformis khi tái tổ hợp vào chủng B. subtilis WB600[33]. So sánh với các nghiên cứu về biểu hiện keratinase trong hệ biểu hiện B.subtilis đã được công bố, chủng B.subtilis 168M tái tổ hợp của chúng tôi có hoạt tính cao hơn hẳn so với hoạt tính 330 U/ml trong nghiên cứu của Liu và cộng sự [33] và 150 U/ml của Lin cùng với cộng sự [31]. Một nghiên cứu khác của Liu và cộng sự [33], để khám phá một hệ thống biểu hiện tốt hơn để sản xuất keratinase, nhóm tác giả này đã phân tích so sánh các hệ thống biểu hiện keratinase, bằng cách sử dụng gen từ vi khuẩn Bacillus
licheniformis keratinase BBE11-1 được thể hiện trong Escherichia coli, Bacillus subtilis và P. pastoris. Với cùng điều kiện tối ưu các hoạt độ keratinase tối đa thu
được từ B. subtilis tái tổ hợp là 3.010 U/ml và P.pastoris là 1.050 U / ml. Nghiên cứu này của Liu và cộng sự cho thấy hoạt độ keratinase tối đa từ B. subtilis là hoạt
B. subtilis là các máy chủ lý tưởng cho sản xuất keratinase, với các ứng dụng tiềm
năng trong chế biến và thức ăn bổ sung dệt may.
Qua các nghiên cứu cho thấy B. subtilis là chủng chủ thích hợp để sản xuất enzyme tái tổ hợp ở quy mô công nghiệp với những ưu điểm vượt trội như tốc độ sinh trưởng nhanh, khả năng tiết protein ngoại bào mạnh và là chủng vi sinh vật an toàn không gây nội độc tố. Bên cạnh đó, với việc thu nhận enzyme đơn giản và không mấy tốn kém, có thể khẳng định rằng keratinase tái tổ hợp từ chủng
B.subtilis 168M của chúng tôi hoàn toàn phù hợp và đủ tiêu chuẩn cho tinh sạch