2.1. Nguyên liệu
Một số c C hủng vi khuẩn
Chủng Bacillus sp DNd 1.2 phân lập từ lò mổ được xác định có hoạt tính keratinase trong bộ chủng giống Phòng Hệ gen học chức năng, Viện Nghiên cứu hệ gen. Các chủng vi khuẩn vật chọn dòng và chủ biểu hiện: E.coli TOP10F’, BL21 (DE3); Bacillus subtilis 168M.
Vector tách dòng và vector biểu hiện
- Vector tách dòng: vector pJET1.2/blunt và vector pZT57RT được dùng để tách dòng sản phẩm PCR nằm trong bộ kit “CloneJET™ PCR Cloning Kit” (Thermo Scientific).
- Vector biểu hiện trong E.coli: Vector pET32a là một vector thuộc hệ vector pET của hãng Novagen. Đây là vector được thiết kế với mục đích để chọn dòng và biểu hiện ở mức độ cao của các gen ngoại lai ở vi khuẩn E. coli. Vector pET32a (5.900 bp) thường được sử dụng với mục đích chính là biểu hiện gen (Hình 6).
- Vector biểu hiện trong B.subtilis: Vector pHT43 thuộc hệ vector pHT mua của hãng Mobitec (CHLB Đức) được thiết kế chuyên để biểu hiện trong tế bào Bacillus subtilis(Hình 6).
Hình 6. Vector biểu hiện
*Hóa chất
Dream Taq Polymerase (Thermo scientific, Mỹ), dNTPs (Thermo scientific, Mỹ), các enzyme giới hạn (NEB, Mỹ). Các cặp mồi được cung cấp bởi IDT, Mỹ. Enzyme giới han hạn BamHI, NcoI... của Thermo scientific, Mỹ, . LB medium,, Tris/HCl,... (Sigma).
Thành phần môi trường khoáng (g/L): MgSO4.7H2O 0,25; FeCl3.6H2O 0,14; CaCl2.2H2O 0,1; MnSO4.4H2O 0,01; ZnSO4.7H2O 0,001; Na citrat 1; dung dịch vi lượng 2 mL; K2HPO4 3; KH2PO4 1,5; (NH4)2SO4 5; Tryptophan 0,8; Glucose 6,5 .Môi trường
- Môi trường khoáng (g/L): MgSO4.7H2O 0,25; FeCl3.6H2O 0,14; CaCl2.2H2O 0,1; MnSO4.4H2O 0,01; ZnSO4.7H2O 0,001; Nanitrat 1; dung dịch vi lượng 2 mL; H2PO4 3; KH2PO4 1,5; (NH4)2SO4 5; Tryptophan 0,8; Glucose 6,5.
- Môi trường SMM: Saccarose : 0,5 mol/l; Axit malic: 0,02 mol/l; MgCl2: 0,02 mol/l.
- Môi trường SMMP: Gấp đôi thành phần môi trường SMM + 40% PEG 6000 với tỉ lệ thể tích 1:1.
Trình tự mồi oligonucleotide
Trình tự mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gen Ker được thiết kế dựa theo trình tự nucleotide từ đoạn gen keratin của chủng B. subtillis đã được đăng kí trên ngân hàng cơ sở dữ liệu GenBank có gắn thêm trình tự enzyme giới hạn. Để chọn một hệ thống biểu hiện tốt để sản xuất kKeratinase, chúng tôi sử dụng gen từ chủng
Bacillus sp DNd 1.2 biểu hiện trong Escherichia coli và Bacillus subtilis. Qui ước
Bảng 1. Trình tự các cặp mồi Gen KerE kerE-F 5’-CGTGGGATCCAAAAAATTGTGGATCAGC-3’ kerE-R 5’-TTATTCTCGAGCTGCTTGTACGTTGAT-3’ Gen KerB KerB-F 5’-ATGGCGTTCAGCAACATGTC-3’ KerB-R 5’-TTAGCAGCCGGATCTCAGTGG-3’ Promoter của gen α- amylase P1Bs 5’-TTGATTTGTATTCACTCTGCC-3’ PK 5’-GACATGTTGCTGAACGCCATTCTTGACA CTCCTTATTTGA-3’ 2.2.Phương pháp Sơ đồ nghiên cứu