M: Marker1kb; 1 sản phẩm cắt bằn g2 enzyme giới hạn XhoI và XbaI; 2 Đối chứng là gen keratinase; 3: Đối chứng là vector pJET1
3.3.4. Biểu hiện gen Ker trong E.coli BL
Trong nghiên cứu biểu hiện đã sử dụng chủng chủ là này E. coli BL21(DE3)
được sử dụng làm vật chủ để biểu hiện protein tái tổ hợp. Đây là chủng chứa đột biến Ion protease (protease nội bào) và ompT protease (protease màng ngoài tế bào). Do vậy, E. coli BL21(DE3) có ưu điểm là hạn chế sự phân cắt của protease đối với protein ngoại lai, giúp cho protein ngoại lai tránh bị phân hủy và ổn định hơn sau khi tổng hợp. Ngoài ra, DNA hệ gen của BL21(DE3) có chứa gen mã hóa cho T7 RNA polymerase, có nguồn gốc từ bacteriophage T7. Gen này được đưa vào hệ gen của chủng E. coli BL21(DE3) và đặt dưới sự điều khiển của promoter lac. T7 RNA polymerase là enzyme hoạt động mạnh, có khả năng sao chép hoàn toàn bất kỳ trình tự DNA nào đặt dưới sự kiểm soát của T7 promoter.
Protein tái tổ hợp trong E. coli có thể tồn tại ở dạng thể vùi hoặc thể hòa tan. Yếu tố quan trọng nhất trong việc biểu hiện một protein ngoại lai trong E. coli là
nhiệt độ và nồng độ IPTG. Các yếu tố khác như nếp gấp nội bào protein, hoạt động protease nội sinh, tốc độ sinh trưởng của tế bào... cũng có thể ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện [52]. Các vấn đề như khả năng biểu hiện thấp hoặc sự hình thành thể vùi thường gây ra bởi yếu tố kị nước được quy định bởi trình tự axit amin mang tín hiệu kỵ nước đầu N của phân tử protein mới được tổng hợp [26]. Để đạt được mức độ biểu hiện cao nhất, các dòng tế bào mang vector tái tổ hợp pET32a- KerE được nuôi cấy ở các điều kiện nhiệt độ, nồng độ IPTG, thời gian biểu hiện khác nhau. Qua các kết quả nghiên cứu, chủng E. coli mang gen ker tái tổ hợp biểu hiện tốt nhất ở điều kiện 200 vòng/ phút, 37oC, nồng độ IPTG 1mM như phần 2.2.10. Vì keratinase tái tổ hợp này có thể được thể hiện trong tế bào chất của vi khuẩn E. coli [26], nên chúng tôi tập trung thu hồi protein ở dạng hòa tan. Protein ngoại laại được thu hồi sau 4 giờ cảm ứng và điện di trên gel SDS 12,5% thu được được kết quả như hình 14.
Hình 14: : Đinh ợc được kết quả như hình 14 và đtein ở dởinh ợc được kế. Giếng M: Thang protein chuẩn (14-116 kDa); 1: Protein tổng số từ E. coli BL21(DE3) [pET32a - Ker2] không cảm ứng IPTG; 2: Protein tổng số từ E. coli
BL21(DE3) [pET32a – KerE] được cảm ứng bởi 1mM IPTG.
Kết quả điện di cho thấy, mẫu protein được cảm ứng xuất hiện một băng đậm hơn hẳn so với mẫu không cảm ứng. Dòng tế bào E. coli mang vector pET32a-KerE
tổng hợp được protein ngoại lai có kích thước khoảng 36 kDa (giếng 2). Điều này khẳng định chúng tôi đã biểu hiện thành công gen KerE trong tế bào E. coli
BL21(DE3).
Theo các nghiên cứu về biểu hiện gen keratinase, kích thước protein tạo ra có sự khác nhau tùy theo nguồn gốc của gen và hệ vector biểu hiện. Khối lượng phân tử của keratinase khoảng 18-200 kDa, ngoại trừ một enzyme đặt biệt từ một loại nấm gây bệnh [24]. Đối với gen keratinase từ chủng B. licheniformis, đã có nhiều nghiên cứu thành công trong việc biểu hiện gen này ở cả E coli và tế bào nấm men
Pichia [29, 48]. Kích thước keratinase từ chủng B.licheniformis khoảng 33 kDa. Tuy nhiên, khi biểu hiện gen này với vector pET30a và pET32a trong E. coli lại có kích thước 45 và 55 kDa [29]. Một nghiên cứu khác của Radha S và cộng sự khi biểu hiện gen này trong nấm men P. pastoris lại có kích thước khoảng 39 kDa [48]. Gen keratinase được phân lập từ chủng B. licheniformis HT10, khi biểu hiện với vector pET22b trong E. coli, chỉ có kích thước khoảng 28 kDa. Kích thước protein thu được nhỏ hơn nhiều so với các kích thước đã được công bố. Chủng Bacillus subtilis là một trong những chủng vi khuẩn có khả năng thủy phân lông vũ cao nhất
và là nguồn nguyên liệu gen keratinase rất phổ biến trong nghiên cứu. Kích thước của protein keratinase từ chủng này cũng có sự khác nhau trong các công bố trước đây như 25,4 kDa [45], 32 kDa [49], và 22kDa [25]. Protein từ chủng B. subtilis Đ.nđ1.2 trong nghiên cứu của chúng tôi khi biểu hiện với vector pET32a trong E.
coli lại có kích thước cao hơn, khoảng 36 kDa.
Kích thước protein keratin tái tổ hợp có sự chênh lệch có thể do hiện tượng cắt ngắn hoặc biến đổi trong quá trình hoàn chỉnh protein trước khi ra khỏi tế bào.