M: Marker1kb; 1 sản phẩm cắt bằn g2 enzyme giới hạn XhoI và XbaI; 2 Đối chứng là gen keratinase; 3: Đối chứng là vector pJET1
3.4.4.1Kiểm tra khả năng thủy phân keratin của chủng B.subtilis 168M tái tổ hợp
43SmaI và KpnI. 1: Plasmid pHT43 mang tổ hợp [Bspr.Ker] đã cắt bằng SmaI và KpnI. 2: Plasmid pHT43 không mang tổ hợp [Bspr.Ker]. M: Marker 1kb (NEB)
Kết quả trên hình cho thấy plasmid tách chiết sau được cắt bằng enzyme giới hạn xuất hiện hai băng DNA, 1 băng có kích thước khoảng 8000 bp bằng đúng kích thước vector pHT43, 1 băng có kích thước khoảng 1100 bp bằng đúng kích thước đoạn gen ngoại lai [Bspr.KerB]. Trong khi đó, mẫu đối chứng là vector pHT43 không mang gen ngoại lai, sau khi được cắt bằng enzyme giới hạn chỉ xuất hiện một băng duy nhất có kích thước đúng bằng khoảng 8000 bp . Điều này khẳng định chúng tôi đã thiết kế thành công vector tái tổ hợp pHT43. Các plasmid pHT43 mang đoạn gen tái tổ hợp [Bspr.KerB] với kích thước khoảng 1,1 kb sẽ được thu nhận để tiến hành biến nạp vào tế bào trần B. subtilis 168M.
3.4.4 Biểu hiện keratinase trong tế bào Bacillus subtilis 168M
3.4.4.1 Kiểm tra khả năng thủy phân keratin của chủng B.subtilis 168M tái tổhợp hợp
Vector biểu hiện [pHT43.Bsp.KerB] thu nhận sau quá trình tách plasmid ở trên được biến nạp vào tế bào trần chủng B.subtilis 168M. Kết thúc quá trình nuôi cấy, các tế bào B. subtilis 168M mang vector tái tổ hợp [pHT43.Bspr.KerB] sẽ được thu nhận và kiểm tra hoạt tính trên đĩa LB agar + 1% azokeratin (Hình 18). Kết quả kiểm tra cho thấy ở các khuẩn lạc có hoạt tính, plasmid đều có chứa đoạn DNA ngoại lai, trong khi ở khuẩn lạc đối chứng (plasmid không mang đoạn DNA ngoại
~8000 bp
lai) thì không thể hiện hoạt tính thủy phân cơ chất. Các kết quả trên cho phép khẳng định hoạt tính của các khuẩn lạc tái tổ hợp là do gen ker ngoại lai ở vector quyết
định.
Hình18 . Kết quả kiểm tra hoạt tính các tế bào B. subtilis 168M mang vector tái tổ hợp pHT43[Bspr.Ker]: Chủng dại (1); Các tế bào B. subtilis 168M mang vector tái tổ hợp pHT43[Bspr.Ker] (2,3,4,5,8,9,10); B. subtilis 168M mang vector pHT43 (6,7).