Thử hoạt tính của keratinase
2.2.5. Điện di protein trên gel Polyacrylamide (SDS-PAGE)
Điện di trên gel polyacrylamide để phân tách các protein theo tính linh động trong điện di của chúng. Không giống axit nucleic, protein thường không mang điện tích đồng đều hay có cấu trúc đồng nhất dọc chiều dài phân tử. Khi được xử lý với chất tẩy mạnh như SDS cấu trúc bậc 2,3,4 của protein sẽ bị phá vỡ. SDS tạo thành lớp vỏ ion tích điện âm bao quanh làm protein đồng đều dọc phân tử. Trên cơ sở này, sự phân tách protein trong điện di chủ yếu do sự khác biệt về kích thước và khối lượng phân tử. Để tăng cường khả năng phân tách, protein được điện di trên gel SDS – PAGE gồm 2 lớp gel cô 5% và gel tách 12,5% được trình bày trong bảng 3.
Bảng 3. Thành phần gel cô 5% và gel tách 12,5% polyacrymide
Thành phần Gel cô 5% Gel tách 12,5%
Tris-Cl 1M, pH 6,8 130 µl 0 Tris-Cl 1M, pH 8,8 0 1,04 ml Bis-acrylamide 170 µl 1,7 ml SDS 10% 10 µl 40 µl APS 10% 10 µl 40 µl TEMED 2 µl 5 µl Tổng số 1 ml 4 ml
2.2.6. Thiết kế vector biểu hiện trong E. coli
Gen keratinase được tách dòng trong vector pJET1.2 theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Xử lý vector pJET1.2 – Ker và pET32a(+) bằng 2 enzyme giới hạn là
BamHI và XhoI, với thành phần như sautrong bảng 4.
Bảng 4 . Thành phần phản ứng cắt với enzyme XhoI và BamHI
Thành phần Thể tích (µl)
H2O 23
Buffer Tango 10X 5
XhoI 1
plasmid DNA 20
Tổng 50
Sản phẩm của phản ứng cắt được ủ ở 370C trong 3h, sau đó được điện di trên gel agarose 0,8%. Đoạn gen keratinase và vector pET32a sau khi tinh sạch bằng thôi gel được gắn vào với nhau bằng enzyme T4 ligase (Biobasic). Sản phẩm gắn được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli. Thu nhận các khuẩn lạc mọc được trên đĩa môi trường có bổ sung kháng sinh chọn lọc ampicillin nồng độ cuối cùng là 50 µg/ml để tiến hành tách tách DNA plasmid. Cắt kiểm tra plasmid bằng enzyme giới hạn như trên.