Kết quả điện di trên gel thu được 1 băng đơn nhất, gen KerE có kích thước khoảng 1,2 kb và gen KerB có kích thước gần 1 kb, hoàn toàn đúng kích thước như chúng tôi mong đợi. Điều này chứng tỏ gen keratinase đã được khuếch đại thành công để biểu hiện trong 2 chủng khác nhau là KerE biểu hiện trong chủng E.coli
BL21 và gen KerB trong chủng B.subtilis 168M. Do đó bước tiếp theo hai sản phẩm PCR này sẽ được tinh sạch để tiến hành tách dòng và biểu hiện.
3.3. Biểu hiện gen keratinase trong E.coli
3.3.1. Tách dòng gen KerE trong vector pJET1.2 để biểu hiện trong E.coli
Gen KerE được nhân lên từ DNA tổng số của chủng B. subtilis ĐNđ1.2 bằng cặp mồi KerE. Dựa trên trình tự gen ker mã hóa cho protease serin kiềm của các B.
subtilis ĐNđ1.2 được đăng kí trên GenBank có kích thước khoảng 1,2 kb, trình tự
gen kerE được đưa vào phần mềm phân tích để có được sơ đồ tổng thể về vị trí trên gen được nhận biết bởi các enzyme hạn chế. Dựa vào sơ đồ đó, 2 điểm cắt của 2 enzyme giới hạn XhoI và BamHI được gắn vào đoạn mồi của gen KerE.
Sản phẩm của phản ứng PCR được tinh sạch và xử lý với enzyme đầu bằng theo quy trình của Kit tách dòng CloneJET™ PCR Cloning Kit - Thermo Scientific để tạo vector tái tổ hợp pJET1.2 – KerE.
Sản phẩm của phản ứng nối được tiến hành biến nạp vào tế bào khả biến
E.coli TOP10F’ theo các bước mụcqui trình 2.2.7, trên đĩa môi trường LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc để chọn lựa được tế bào mang vector tái tổ hợp. Trong quá trình sinh trưởng của E. coli, plasmid được nhân lên với số lượng lớn. Để chọn ra đúng các plasmid mang gen Ker, các dòng tế bào E. coli tái tổ hợp được chọn lọc trên môi trường có bổ sung kháng sinh và tách chiết plasmid để kiểm tra sự có mặt của gen ker trong plasmid. Để tiến hành tách chiết DNA plasmid từ chủng tái tổ hợp, cần tiến hành nuôi cấy một số khuẩn lạc trong môi trường LB lỏng có bổ sung Ampicillin (50 mg/ml) ở nhiệt độ 37°˚C từ 12-14 giờ và DNA plasmid được tách chiết theo qui trìnhcác bước mục 2.2.3. Theo lý thuyết khi một DNA plasmid mang gen ngoại lai, chúng sẽ có kích thước bằng tổng kích thước của plasmid và kích thước của gen ngoại lai. Tức là các plasmid có kích thước cao hơn so với plasmid đối chứng âm có thể là vector chọn dòng không mang gen ngoại lai. Để kiểm tra chính xác kết quả của phản ứng nối chúng tôi chọn các plasmid có kích thước cao hơn đem xử lý bằng các enzyme giới hạn. Ở đây, chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng
enzyme hạn chế, đó là 2 enzyme hạn chế XhoI và BamHI. Các enzyme được lựa chọn là những enzyme nằm trong vùng MCS - Multiple Cloning Site của vector. r.
Sản phẩm của phản ứng cắt được ủ ở 370C trong 3h, rồi đem kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 0,8%. Theo lý thuyết, các plasmid tái tổ hợp khi được xử lý bằng enzyme cắt sẽ tạo thành 2 băng trên bảng điện di. Một băng có kích thước đúng bằng kích thước của vector ~3 kb, băng còn lại có kích thước bằng kích thước của đoạn gen được chèn vào khoảng 1,2 kb.
Hình 11: Điện di sản phẩm cắt bằng 2 enzyme giới hạn XhoI và BamHI. I