M: Marker1kb; 1 sản phẩm cắt bằn g2 enzyme giới hạn XhoI và XbaI; 2 Đối chứng là gen keratinase; 3: Đối chứng là vector pJET1
3.4.4.2 Điện di enzyme keratinase tái tổ hợp trên gel SDS-PAGE
Các tế bào B. subtilis 168M tái tổ hợp đã được xác định có khả năng thủy phân keratin cao ở trên được nuôi trên môi trường phục hồi có bổ sung kháng sinh chọn lọc chloramphenicol 0,5 mg/ml. Sau quá trình nuôi lắc, toàn bộ dịch canh trường được ly tâm loại tế bào và thu dịch nổi được coi là dịch enzyme thô do tính chất của các chủng vi khuẩn Bacillus là tiết enzyme ngoại bào ra bên ngoài môi trường trong quá trình sinh trưởng và phát triển.
Dịch enzyme thô này được kiểm tra sự xuất hiện của enzyme keratinase tái tổ hợp bằng cách điện di trên gel poly acrylamide (SDS-PAGE) 12,5%. Kết quả điện di protein được thể hiện trên hình.
Hình 19 :Đi9hatinase tenzyme thô trên gel SDS-PGE
Kết quả điện di trên gel SDS-PAGE cho thấy một băng sáng rõ nhất có kích thước vào khoảng 25 kDa, băng protein không hề xuất hiện bên dịch enzyme thô đối chứng từ chủng B.subtilis 168M hoang dại. Điều đó cho thấy băng protein này có khả năng là băng keratinase tái tổ hợp của chủng B.subtilis 168M. Kết quả này được đem so sánh với một nghiên cứu trước đây của Liu và cộng sự [33]. Trong công bố này, các tác giả đã tiến hành biển hiện keratinase trong chủng B.subtilis WB600 và kết quả điện di trên gel SDS-PAGE đã cho thấy băng keratinase tái tổ hợp sau khi tinh sạch có kích thước vào khoảng gần 30 kDa. Kết quả này cộng thêm với chủng B.subtilis 168M tái tổ hợp của chúng tôi đã được chứng minh có khả năng thủy phân keratin cao ở phần trên đã chứng minh băng protein trên bản điện di đúng là băng keratinase tái tổ hợp.
Đến đây, có thể nói cChúng tôi đã thành công trong việc biểu hiện keratinase trong chủng B.subtilis 168M bằng phương pháp tái tổ hợp gen KerB với promoter của chủng vi khuẩn này. Phương pháp tái tổ hợp gen này đảm bảo cho quá trình dịch mã ổn định và chính xác cho keratinase trong hệ biểu hiện Bacillus bằng vector pHT43. Phương pháp này cũng đã được sử dụng thành công cho hoạt tính cao trong một nghiên cứu đã được công bố [31].