3. Ý nghĩa khoa học của đề tài
2.3.4.Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
- Buồng cấy có lọc và phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 2+, - Hộp bảo quản và vận chuyển mẫu chuyên dụng,
- Cân phân tích, - Máy ly tâm lạnh, - Máy lắc Stat fax 2200,
- Máy đọc ELISA [đo giá trị OD (ELx800)], - Máy khuấy từ,
- Pipet chính xác, đơn kênh và đa kênh các loại, - Máy và thiết bị thông thường phòng thí nghiệm, - Các dụng cụ và hoá chất khác.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp lấy mẫu máu
- Dùng syringe hút 3 ml máu từ tĩnh mạch cổ của trâu, bò.
- Tách huyết thanh vào ống Eppendorf, bảo quản ở nhiệt độ 2 - 40C, gửi đến phòng thí nghiệm.
- Bảo quản huyết thanh ở 4oC nếu xét nghiệm trong 1 tuần hoặc - 30o
C nếu chưa xét nghiệm ngay.
2.4.2. Phương pháp lấy mẫu biểu mô
- Kiểm tra lâm sàng và chọn gia súc mới phát bệnh, bệnh phẩm được lấy từ các tổn thương mới (không lấy mẫu từ các tổn thương ở giai đoạn lành sẹo hoặc đã được sát trùng và điều trị) [28].
- Thu thập mẫu biểu mô ở những gia súc có triệu chứng của bệnh LMLM theo hướng dẫn của Cục thú y và tuân thủ các quy tắc an toàn sinh học theo hướng dẫn của OIE để tiến hành xét nghiệm và định type vi rút.
- Loại mẫu là biểu mô lưỡi, lợi, kẽ móng chân, viền móng chân bị bong tróc do mụn nước mới vỡ ra, dịch trong mụn nước.
- Mẫu bệnh phẩm được bảo quản 4 - 8°C trong hỗn hợp PBS 0,04 M và Glycerin (tỷ lệ 1 : 1) pH = 7,2 - 7,6 trong suốt quá trình vận chuyển về phòng thí nghiệm.
- Bảo quản mẫu bệnh phẩm ở 4°C nếu xét nghiệm trong 1 - 3 ngày hoặc - 80°C nếu chưa xét nghiệm ngay [28].
2.4.3. Phương pháp 3ABC - ELISA phát hiện kháng thể nhiễm tự nhiên
Chẩn đoán phát hiện kháng nguyên 3ABC chứng tỏ gia súc nhiễm vi rút tự nhiên bằng cách sử dụng FMD - 3ABC bo-ov ELISA Test KIT (mã FBT139T) do phòng thí nghiệm IDEXX Thụy Sỹ cung cấp, được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các bước tiến hành được tóm tắt như sau [24]:
- Bước 1: Gắn 50 µl kháng huyết thanh thỏ kháng vi rút LMLM (serotype O, A và Asia 1) cho vào mỗi lỗ trên các đĩa ELISA, để qua đêm ở nhiệt độ 4°C.
- Bước 2: Trên các lỗ của đĩa có đáy hình chữ U cho 50 µl huyết thanh kiểm tra và đối chứng pha loãng gấp 2 lần, được chuẩn bị bắt đầu từ độ pha loãng 1/4. Thêm 50 µl kháng nguyên vi rút tương đồng vào mỗi lỗ sau đó trộn đều và để qua đêm ở nhiệt độ 4°C hoặc ủ ấm ở 37°C trong 1 giờ.
- Bước 3: Các đĩa ELISA được rửa 3 lần bằng dung dịch PBS.
- Bước 4: Chuyển hỗn hợp 50 µl huyết thanh/kháng nguyên từ đĩa đáy chữ U sang các đĩa ELISA đã phủ huyết thanh thỏ và ủ ấm ở nhiệt độ 37°C trong 1 giờ ở máy lắc quay.
- Bước 5: Sau khi rửa, cho 50 µl kháng huyết thanh chuột lang tương ứng với kháng nguyên vi rút đã sử dụng vào mỗi lỗ. Sau đó đem ủ ở 37°C trong 1 giờ ở máy lắc quay.
- Bước 6: Rửa các đĩa phản ứng rồi đem thêm vào mỗi lỗ 50 µl huyết thanh thỏ miễn dịch kháng globulin chuột lang gắn men Peroxidaza. Các đĩa ELISA này được ủ ở 37°C trong 1 giờ ở máy lắc quay.
- Bước 7: Các đĩa này lại được rửa sạch và thêm vào mỗi lỗ 50 µl Substrate bao gồm 0,05% H2O2 (30%). Để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, không lắc.
- Bước 8: Phản ứng được dừng lại sau 15 phút bằng dung dịch 1,25 M Acid Sulfuric. Các đĩa phản ứng được đọc bằng máy ELISA ở bước sóng 492 nm.
- Bước 9: Giải thích kết quả: hiệu giá kháng thể được thể hiện ở độ pha loãng cuối cùng của huyết thanh thử có 50% giá trị hấp thu trung bình trong các lỗ kiểm tra vi rút nơi mà không có huyết thanh thử. Nếu hiệu giá > 1/40 thì được coi là dương tính. Nếu hiệu giá ≤ 1/40 thì nên kiểm tra lại bằng phản ứng trung hòa vi rút.
2.4.4. Thiết kế thí nghiệm xác định tình hình nhiễm vi rút tự nhiên
Nguyên lý: Gia súc sau khi đã được tiêm phòng vắc xin LMLM sẽ có đáp ứng miễn dịch, cho kết quả dương tính huyết thanh học trong xét nghiệm nhưng cho kết quả âm tính đối với kháng nguyên 3ABC nếu không nhiễm vi rút LMLM tự nhiên [5], [7], [28], [35].
Trong thực tế chỉ những gia súc nhiễm vi rút LMLM tự nhiên cho kết quả dương tính huyết thanh học 3ABC. Tỉnh Lai Châu những năm gần đây việc tiêm phòng vaccin LMLM cho đàn trâu bò đều sử dụng các loại vắc xin đa giá type (O, A, Asia1) hoặc đơn giá type O, đây là các loại vắc xin vô hoạt do hãng Merial và Intervet sản xuất, đã được loại bỏ kháng nguyên phi cấu trúc 3ABC, do đó sau khi tiêm, gia súc chỉ sản sinh các kháng thể đặc hiệu chống vi rút LMLM chứ không sản sinh kháng thể kháng lại kháng nguyên phi cấu trúc 3ABC [28]. Để đánh giá tình hình nhiễm vi rút tự nhiên tại tỉnh Lai Châu, đề tài tiến hành xét nghiệm ELISA sử dụng kit phát hiện kháng thể 3ABC.
Thiết kế thí nghiệm: Để có số liệu mang tính đại diện cho tỉnh, đề tài tiến hành thu thập mẫu theo phương pháp phân tầng ngẫu nhiên. Tỉnh Lai Châu có 7 huyện, thị xã, đề tài tiến hành chọn ngẫu nhiên bốn huyện bằng phương pháp bốc thăm. Tại mỗi huyện, đề tài lựa chọn ngẫu nhiên 1 xã bằng phương pháp bốc thăm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu
- Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để xử lý số liệu thống kê, phần mền Map Info để vẽ bản đồ dịch tễ bệnh LMLM.
- Tính các chỉ số dịch tễ theo phương pháp truyền thống. Cụ thể:
Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh (%) = Số trâu, bò mắc bệnh x 100 Tổng số trâu, bò
Tỷ lệ mắc bệnh theo lứa tuổi (%) = Số trâu, bò mắc bệnh theo lứa tuổi x 100 Tổng số trâu, bò mắc bệnh
Tỷ lệ chết (%) = Số trâu, bò chết do bệnh x 100 Tổng số trâu, bò mắc bệnh
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh LMLM tỉnh Lai Châu giai đoạn 2006 - 2011 đoạn 2006 - 2011
3.1.1. Tình hình dịch LMLM tỉnh Lai Châu từ 2006 đến 2011
Vi rút LMLM có thể lây nhiễm cho tất các động vật móng guốc chẵn. Vi rút nhiễm vào động vật cảm thụ, nhân lên, sau đó được bài thải qua các đường tự nhiên (hơi thở, phân, nước dãi, tinh dịch...) hoặc qua sản phẩm của động vật (sữa, thịt, xương...). Như vậy, động vật cảm thụ là khâu đóng vai trò quyết định trong sự lưu hành của vi rút. Để thu thập thông tin về đặc tính cảm thụ và vai trò của các loài vật nuôi chính trong sự lây nhiễm và lưu hành của vi rút LMLM tại tỉnh Lai Châu, chúng tôi đã hồi cứu và thống kê tình hình các loài vật mắc bệnh trong 6 năm liên tục, từ 2006 - 2011. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1. Tổng hợp số ổ dịch LMLM ở các huyện của tỉnh Lai Châu (2006- 2011)
TT Huyện, thị xã Số ổ dịch Tính chung theo địa phƣơng 2006 2007 2008 2009 2010 2011 1 TX. Lai Châu 5 0 0 0 1 3 9 2 Tam Đường 13 0 0 0 3 14 30 3 Tân Uyên 0 0 0 1 1 10 12 4 Than Uyên 0 0 0 1 0 6 7 5 Phong Thổ 3 7 0 0 3 16 29 6 Sìn Hồ 0 0 0 0 0 16 16 7 Mường Tè 0 0 0 0 12 13 25
Bảng 3.1 cho thấy:
- Trong 6 năm từ 2006 - 2011, tại tỉnh Lai Châu đã xảy ra 128 ổ dịch LMLM, nghĩa là số ổ dịch xuất hiện bình quân ở mỗi huyện, thị là 3,04 ổ dịch/năm (128/7 huyện/6 năm = 3,04).
- Số ổ dịch LMLM dao động tùy theo địa phương, trong vòng 6 năm có 2 huyện có dưới 10 ổ dịch là TX Lai Châu (9 ổ dịch) và huyện Than Uyên (7 ổ dịch); rồi đến Tân Uyên (12 ổ dịch), Sìn Hồ (16 ổ dịch) và cao nhất là 3 huyện Mường Tè (25 ổ dịch), Phong Thổ (29 ổ dịch), Tam Đường (30 ổ dịch).
- Số lượng ổ dịch được hiểu theo nghĩa rộng của ổ dịch và được giới hạn trong phạm vi không gian là một đơn vị hành chính cấp xã (xã có dịch gọi là một ổ dịch); thời gian hết dịch được xác định là sau 21 ngày kể từ khi con gia súc mắc bệnh cuối cùng mà không có con nào mắc thêm được tính là kết thúc một ổ dịch. Ví dụ dịch xuất hiện ở các xã thuộc 3 huyện Tam Đường, Phong Thổ, TX Lai Châu năm 2006, kéo dài trên 3 tháng (từ tháng 6 đến tháng 9) chỉ tính là 1 ổ dịch. Ngược lại, tại 1 xã, có thể có trên 1 ổ dịch/năm nếu dịch phát ra vào các thời điểm khác nhau trong năm.
- Trong suốt 6 năm qua, gần như năm nào cũng có dịch, ngoại trừ năm 2008. Số ổ dịch biến động theo thời gian (năm) được minh họa ở biểu đồ hình 3.1.
- Số ổ dịch trung bình tại tỉnh Lai Châu là 21,3 ổ dịch/năm, số ổ dịch cao ngay từ khi tái phát (năm 2006, có 26 ổ dịch) sau đó giảm dần ở các năm tiếp theo (từ năm 2007 đến 2010 có 29 ổ dịch), rồi tăng đến đỉnh điểm là 78 ổ dịch trong năm 2011 (78/103 xã có dịch).
- Đặc điểm quy luật dịch tễ không theo chu kỳ. Tại 1 huyện, dịch có thể xuất hiện và tái phát 2 - 3 năm liên tục như huyện Phong Thổ có 4/6 năm có dịch, nhưng có huyện sau vài năm dịch mới tái phát như Tam Đường, thị xã Lai Châu.
Nhận xét chung: Trong 6 năm (2006 - 2011), dịch LMLM đã liên tục
xảy ra ở tỉnh Lai Châu, mỗi năm trung bình có 21,3 ổ dịch (tần suất 3,04 ổ dịch/huyện/năm). Diễn biến dịch không mang tính chất chu kỳ, mà có thể kéo dài hay tái phát liên tục trong nhiều năm trong một xã hoặc 1 huyện.
3.1.2. Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh LMLM ở tỉnh Lai Châu từ năm 2006 - 2011
Để tính tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh LMLM ở tỉnh Lai Châu giai đoạn 2006 - 2011, chúng tôi thống kê số lượng trâu, bò mắc bệnh theo từng mùa và từng năm. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2a, 3.2b và hình 3.2
Bảng 3.2a: Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh LMLM qua các năm (tách riêng trâu và bò)
Năm Trâu Bò Tổng đàn (con) Số con mắc bệnh (con) Tỷ lệ mắc (%) Tổng đàn (con) Số con mắc bệnh (con) Tỷ lệ mắc (%) 2006 86.102 3.678 4,27 11.922 292 2,45 2007 92.378 577 0,63 12.436 0 0,00 2008 88.968 0 0,00 13.600 0 0,00 2009 92.742 132 0,14 14.342 15 0,10 2010 98.785 1.795 1,82 15.059 183 1,22 2011 99.900 6.254 6,26 15.600 547 3,51 Tổng 558.875 12.436 2,23 82.959 1.037 1,25
- Số ca bệnh và tỷ lệ tính cả số gia súc mắc bệnh và xử lý tiêu huỷ
- Tỷ lệ trâu mắc bệnh không bao gồm năm 2008, tỷ lệ bò mắc bệnh không bao gồm năm 2008, 2009.
Bảng 3.2b: Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh LMLM theo năm (tính chung trâu, bò)
Năm Tổng đàn trâu, bò Số mắc Tỷ lệ mắc (con) (con) (%) 2006 98.024 3.970 4,05 2007 104.814 577 0,55 2008 102.568 - 0,00 2009 107.084 147 0,14 2010 113.844 1.978 1,74 2011 115.500 6.801 5,89 Cộng 641.834 13.473 2,10 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.2. Đồ thị tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh LMLM theo năm
Kết quả ở các bảng 3.2a, 3.2b và hình 3.2 cho thấy:
- Trâu, bò có tỷ lệ mắc bệnh bình quân 2,10%/năm; tính riêng trâu mắc 2,23%/năm, bò là 1,25%/năm. Đặc điểm này khác với một số nghiên cứu về tính cảm thụ loài đối với vi rút LMLM, trong đó trâu mẫn cảm với vi rút
LMLM hơn bò [15], [19], [22], [30]. Sự khác biệt này có thể do: tại tỉnh Lai Châu, số lượng trâu gấp 9 lần bò. Và đây là nguồn mầm bệnh quan trọng có khả năng làm bệnh LMLM lây lan ở tỉnh Lai Châu.
Kết quả về tỷ lệ mắc bệnh của nghiên cứu này cho thấy tại tỉnh Lai Châu, tỷ lệ mắc bệnh LMLM tương đương một số nơi khác như đã thông báo trước đây: 1,93% năm 1996 [26] hoặc 0,64% năm 2011 [15].
- Trong 6 năm (2006-2011), năm nào cũng có dịch, trừ năm 2008, trong mỗi năm số tháng có dịch khác nhau; ở cả trâu và bò, tỷ lệ mắc bệnh cao nhất vào các năm 2006 và 2011. Từ năm 2006 Chương trình khống chế và thanh toán bệnh LMLM Quốc gia được triển khai trên địa bàn tỉnh thì các năm sau, tỷ lệ gia súc mắc bệnh giảm đáng kể và giữ ở mức thấp, tuy nhiên tỷ lệ mắc bệnh lại tăng cao hơn ở năm 2011 nhưng ở mức độ nhẹ.
3.1.3. Thời gian lưu hành bệnh LMLM ở trâu, bò tại tỉnh Lai Châu:
Để tìm hiểu thời điểm phát dịch trong năm, chúng tôi thống kê số trâu, bò mắc bệnh theo mùa, theo năm. Kết quả tổng hợp được trình bày ở bảng 3.3a, 3.3b, 3.3c, 3.3d.
Bảng 3.3a. Số ca bệnh LMLM ở trâu qua các năm theo mùa (2006 - 2011).
Mùa
Huyện Xuân Hạ Thu Đông theo huyện Tổng
TX. L.Châu 27 999 277 2 1.305 T.Đường 1.621 726 1.539 30 3.916 Tân Uyên 338 15 - 125 478 Than Uyên 295 - - 67 362 Phong Thổ 1.591 223 196 71 2.081 Sìn Hồ 1.604 128 - - 1.732 Mường Tè 2.359 177 - 26 2.562 Tổng theo mùa 7.835 2.268 2.012 321 12.436
Bảng 3.3b. Số ca bệnh LMLM ở bò qua các năm theo mùa (2006-2011).
Mùa
Huyện Xuân Hạ Thu Đông
Tổng theo huyện TX. L.Châu - 92 18 3 113 T.Đường 95 182 - - 277 Tân Uyên 41 2 - 9 52 Than Uyên 33 - - 6 39 Phong Thổ 115 13 - - 128 Sìn Hồ 133 10 - - 143 Mường Tè 285 - - - 285 Tổng 702 299 18 18 1.037
Bảng 3.3c. Số ca bệnh LMLM ở trâu, bò theo mùa (tính chung trâu, bò)
Năm Mùa 2006 2007 2008 2009 2010 2011 Cộng theo huyện Xuân 1925 90 164 373 2552 Hạ 2.045 - - - - - 2.045 Thu - - - 147 189 - 336 Đông - 487 - - 1.625 6.428 8.540 Cộng theo mùa 3.970 577 - 147 1.978 6.801 13.473
Bảng 3.3d. Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh LMLM qua các năm theo mùa (2006 - 2011)
Mùa Tổng số trâu, bò có trong tháng (con) Số trâu, bò mắc bệnh (con) Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh (%) Xuân 323.233 2.552 0,79 Hạ 324.207 2.045 0,63 Thu 325.180 336 0,10 Đông 322.263 8.540 2,65
Hình 3.3. Đồ thị trâu, bò mắc bệnh LMLM theo mùa
Bảng 3.3a, 3.3b, 3.3c, 3.3d và hình 3.3 cho thấy:
- Số ca bệnh ở trâu rải rác quanh năm, có hai thời điểm số ca bệnh tập trung tăng cao, đó là các tháng mùa đông, mùa xuân (thời điểm trước và sau tết âm lịch) và tháng 6, 8. Số ca bệnh giảm dần từ tháng 9 đến tháng 12.
- Số ca bệnh ở bò cũng rải rác quanh năm, cũng có hai thời điểm số ca bệnh gia tăng là các tháng mùa đông, mùa xuân (thời điểm trước và sau tết âm lịch) và tháng 5. Số ca bệnh giảm dần từ tháng 6 đến tháng 12 (mùa hè và mùa thu).
Nhận xét chung: Nhìn chung bệnh LMLM trên đàn trâu, bò tại tỉnh Lai
Châu xảy ra quanh năm, ở hầu hết các tháng. Tuy nhiên số ca bệnh tập trung nhiều nhất vào mùa đông, mùa xuân (thời điểm trước và sau tết âm lịch), trùng với thời gian có hoạt động vận chuyển và giết mổ gia súc tăng cao) chiếm 65,8% số gia súc mắc bệnh trong năm. Điều này phù hợp với đặc điểm của vi rút LMLM là phát triển tốt trong điều kiện môi trường có nhiệt độ thấp và ẩm độ tương đối cao. Nghiên cứu này tương tự như kết quả của tác giả Nguyễn Văn Hưng [15]. Như vậy trong điều kiện thích hợp cho vi rút LMLM phát triển và công tác kiểm dịch động vật, kiểm soát giết mổ chưa
thật nghiêm ngặt là nguyên nhân làm cho tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh Lở mồm long móng tăng lên.
3.1.4. Lứa tuổi mắc bệnh