3. Ý nghĩa khoa học của đề tài
2.4.3.Phương pháp 3ABC-ELISA phát hiện kháng thể nhiễm tự nhiên
Chẩn đoán phát hiện kháng nguyên 3ABC chứng tỏ gia súc nhiễm vi rút tự nhiên bằng cách sử dụng FMD - 3ABC bo-ov ELISA Test KIT (mã FBT139T) do phòng thí nghiệm IDEXX Thụy Sỹ cung cấp, được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các bước tiến hành được tóm tắt như sau [24]:
- Bước 1: Gắn 50 µl kháng huyết thanh thỏ kháng vi rút LMLM (serotype O, A và Asia 1) cho vào mỗi lỗ trên các đĩa ELISA, để qua đêm ở nhiệt độ 4°C.
- Bước 2: Trên các lỗ của đĩa có đáy hình chữ U cho 50 µl huyết thanh kiểm tra và đối chứng pha loãng gấp 2 lần, được chuẩn bị bắt đầu từ độ pha loãng 1/4. Thêm 50 µl kháng nguyên vi rút tương đồng vào mỗi lỗ sau đó trộn đều và để qua đêm ở nhiệt độ 4°C hoặc ủ ấm ở 37°C trong 1 giờ.
- Bước 3: Các đĩa ELISA được rửa 3 lần bằng dung dịch PBS.
- Bước 4: Chuyển hỗn hợp 50 µl huyết thanh/kháng nguyên từ đĩa đáy chữ U sang các đĩa ELISA đã phủ huyết thanh thỏ và ủ ấm ở nhiệt độ 37°C trong 1 giờ ở máy lắc quay.
- Bước 5: Sau khi rửa, cho 50 µl kháng huyết thanh chuột lang tương ứng với kháng nguyên vi rút đã sử dụng vào mỗi lỗ. Sau đó đem ủ ở 37°C trong 1 giờ ở máy lắc quay.
- Bước 6: Rửa các đĩa phản ứng rồi đem thêm vào mỗi lỗ 50 µl huyết thanh thỏ miễn dịch kháng globulin chuột lang gắn men Peroxidaza. Các đĩa ELISA này được ủ ở 37°C trong 1 giờ ở máy lắc quay.
- Bước 7: Các đĩa này lại được rửa sạch và thêm vào mỗi lỗ 50 µl Substrate bao gồm 0,05% H2O2 (30%). Để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, không lắc.
- Bước 8: Phản ứng được dừng lại sau 15 phút bằng dung dịch 1,25 M Acid Sulfuric. Các đĩa phản ứng được đọc bằng máy ELISA ở bước sóng 492 nm.
- Bước 9: Giải thích kết quả: hiệu giá kháng thể được thể hiện ở độ pha loãng cuối cùng của huyết thanh thử có 50% giá trị hấp thu trung bình trong các lỗ kiểm tra vi rút nơi mà không có huyết thanh thử. Nếu hiệu giá > 1/40 thì được coi là dương tính. Nếu hiệu giá ≤ 1/40 thì nên kiểm tra lại bằng phản ứng trung hòa vi rút.
2.4.4. Thiết kế thí nghiệm xác định tình hình nhiễm vi rút tự nhiên
Nguyên lý: Gia súc sau khi đã được tiêm phòng vắc xin LMLM sẽ có đáp ứng miễn dịch, cho kết quả dương tính huyết thanh học trong xét nghiệm nhưng cho kết quả âm tính đối với kháng nguyên 3ABC nếu không nhiễm vi rút LMLM tự nhiên [5], [7], [28], [35].
Trong thực tế chỉ những gia súc nhiễm vi rút LMLM tự nhiên cho kết quả dương tính huyết thanh học 3ABC. Tỉnh Lai Châu những năm gần đây việc tiêm phòng vaccin LMLM cho đàn trâu bò đều sử dụng các loại vắc xin đa giá type (O, A, Asia1) hoặc đơn giá type O, đây là các loại vắc xin vô hoạt do hãng Merial và Intervet sản xuất, đã được loại bỏ kháng nguyên phi cấu trúc 3ABC, do đó sau khi tiêm, gia súc chỉ sản sinh các kháng thể đặc hiệu chống vi rút LMLM chứ không sản sinh kháng thể kháng lại kháng nguyên phi cấu trúc 3ABC [28]. Để đánh giá tình hình nhiễm vi rút tự nhiên tại tỉnh Lai Châu, đề tài tiến hành xét nghiệm ELISA sử dụng kit phát hiện kháng thể 3ABC.
Thiết kế thí nghiệm: Để có số liệu mang tính đại diện cho tỉnh, đề tài tiến hành thu thập mẫu theo phương pháp phân tầng ngẫu nhiên. Tỉnh Lai Châu có 7 huyện, thị xã, đề tài tiến hành chọn ngẫu nhiên bốn huyện bằng phương pháp bốc thăm. Tại mỗi huyện, đề tài lựa chọn ngẫu nhiên 1 xã bằng phương pháp bốc thăm.
2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu
- Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để xử lý số liệu thống kê, phần mền Map Info để vẽ bản đồ dịch tễ bệnh LMLM.
- Tính các chỉ số dịch tễ theo phương pháp truyền thống. Cụ thể:
Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh (%) = Số trâu, bò mắc bệnh x 100 Tổng số trâu, bò
Tỷ lệ mắc bệnh theo lứa tuổi (%) = Số trâu, bò mắc bệnh theo lứa tuổi x 100 Tổng số trâu, bò mắc bệnh
Tỷ lệ chết (%) = Số trâu, bò chết do bệnh x 100 Tổng số trâu, bò mắc bệnh
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN