- Chi Tetraselmis
b. Phân lập trên môi trường thạch (đối với các loài thuộc chi Tetraselmis)
Phương pháp này chỉ áp dụng đối với các loài VTB có khả năng tạo khuẩn lạc
riêng biệt trên bề mặt thạch, tạo thành các dòng khuẩn lạc khác nhau và từ các dòng này có thể tách ra và ni thành các dịng tế bào thuần chủng. Đây là phương pháp phổ biến, dễ tiến hành và có thể cùng lúc tạo được nhiều dịng tế bào tảo khác nhau.
Chuẩn bị mơi trường thạch: Bổ sung agar với nồng độ 1% vào nước biển có độ
mặn 30‰, bổ sung 1ml/lít mơi trường dung dịch đa lượng và vi lượng của môi trường Walne, sau đó hỗn hợp này được khử trùng ở điều kiện 121oC trong 30 phút và 1atm. Sau khi khử trùng để nguội 40 – 500C, đem đổ vào các đĩa petri đã khử trùng, để nguội và đậy nắp ở điều kiện phòng 1-2 ngày mới mang ra cấy phân lập (cần loại những đĩa
thạch có thể bị nhiễm trong quá trình thao tác).
Mẫu tảo được xử lý bằng hỗn hợp kháng sinh có nồng độ như sau: Ampicillin (250 mg/l), Kanamycin (100 mg/l), Streptomycin (50 mg/l), Gentamycin (50 mg/l) để
loại bỏ vi khuẩn, nấm và các động vật nguyên sinh có trong mẫu tự nhiên. Các mẫu
này sau đó được làm giàu bằng cách ly tâm ở 5.000 vòng/phút trong 5 phút, 4C. Loại
bỏ phần dịch phía trên và sử dụng phần cặn dưới ống ly tâm. Hút 50 - 100 µl dịch tảo từ các mẫu tảo đã được xử lý kháng sinh rồi nhỏ dung dịch hỗn hợp kháng sinh trên
mặt thạch, dùng que cấy platin để cấy thành các vùng tảo có mật độ khác nhau. Để các
đĩa thạch dưới điều kiện chiếu ánh sáng yếu, nhiệt độ 25oC. Sau 2 tuần, tiến hành kiểm
tra dưới kính hiển vi quang học (thời gian cần thiết cho tảo mọc trên thạch thường là 2 đến 4 tuần sau khi cấy) để phát hiện các khuẩn lạc. Nếu phát hiện thấy tảo đã mọc,
dùng kính lúp chọn ra các khuẩn lạc riêng rẽ và tiến hành cấy chuyển sang các đĩa thạch khác nhằm tạo các dịng tế bào thuần. Lặp lại quy trình này cho đến khi thu được dòng tế bào thuần.
2.4.1.2. Chụp ảnh hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử quét (SEM) hiển vi điện tử quét (SEM)
Các loài VTB thuộc 2 chi Chaetoceros và Tetraselmis sau khi phân lập sẽ được quan sát, chụp ảnh hình thái dưới kính hiển vi quang học Olympus CX21 (Nhật Bản) ở
độ phóng đại 400 lần và dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM: Scanning Electron
Microscope) của Viện 69 thuộc Bộ Tư Lệnh Lăng. Các lồi VTB có khả năng chuyển
động sẽ được cố định bằng ethanol 1% trước khi quan sát hình thái tế bào.
Để chụp ảnh SEM, các tế bào của các loài VTB được cố định bằng các chất cố định khác nhau như ethanol 5%, formol 4% hoặc glutaraldehyde 1%. Tuy nhiên, glutaraldehyde 1% cho hiệu quả cố định tế bào vi tảo cao nhất, giữ nguyên được trạng thái tế bào. Các chất còn lại làm vỡ hoặc làm biến dạng hầu hết hoặc một số tế bào.
Đối với các loài VTB có roi như Isochrysis sp., Chroomonas sp. và Tetraselmis sp.,
nồng độ glutaraldehyde thực tế được sử dụng là 3%.
Quy trình cố định mẫu trong 1% glutaradehyde: Tảo đang phát triển ở giữa pha logarit sẽ được cố định bằng cách bổ sung glutaradehyde đến nồng độ cuối cùng là 3%. Sau khi cố định, để tĩnh mẫu ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ, mẫu được ly tâm ở 4.000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch trên và hoà tan cặn tế bào trong nước biển 5‰ bảo đảm MĐTB đạt 105TB/ml. Mẫu sau khi pha lỗng được lọc qua giấy lọc có
kích thước lỗ 0,25 µm, để khơ ở nhiệt độ phịng và cố định lên đế chụp. Sau khi phủ
một lớp vàng mỏng nhằm tăng tính tương phản của mẫu và giúp cho việc chụp mẫu
từ 3.500 đến 15.000 lần. Các tế bào đứng riêng rẽ và có hình dạng đặc trưng cho loài nghiên cứu sẽ được chọn để chụp ảnh.
2.4.1.3. Định tên khoa học hai loài VTB thuộc 2 chi Chaetoceros và Tetraselmis. Tetraselmis.
ADN tổng số của các mẫu VTB nói trên được tách chiết theo như mô tả trong công bố của Đặng Diễm Hồng và cs., 2002 [12].
Đoạn gien 18S rRNA của 2 mẫu VTB quang tự dưỡng thuộc các chi
Chaetoceros và Tetraselmis được khuếch đại bằng phản ứng PCR từ DNA tổng số với
cặp mồi UPro18F: 5’-TAC CAC ATC TAA GGA AGG CAG CAG-3’ và U18R: 5’- GGC ATC ACA GAC CTG TTA TTG C-3’); và cặp mồi Alex F: 5’-GAG AGG GAG CTT GAG AAA TG-3’ và U18R, tương ứng. Sản phẩm PCR có kích thước dự kiến là 1100 bp.
Phản ứng PCR được thực hiện với 20 l hỗn hợp phản ứng chứa 1 l DNA
khuôn, 2 l đệm 10X, 1,5 l 2,5 mM dNTP mỗi loại và 0,3 l Taq polymerase. Chu
trình nhiệt: 940C - phút, 35 chu kỳ (94oC – 30 giây, 55oC – 1 phút, 72oC – 1 phút) và 72oC – 5 phút.
Sau khi chạy điện di để kiểm tra trên gel agarose 0,8%, sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kít tinh sạch Centrifuge Kit, Promega (Mỹ) được đọc trình tự trên máy ABI PRISM (R) 3100 – Avant Genetic Analyzer (Mỹ). Sử dụng các chương trình Clustal X Multiple Sequence Alignment Program (version 1.81, June 2000), DNASTAR và MEGA3, cây phát sinh chủng loại của các loài nghiên cứu với các lồi
tương ứng được cơng bố tại ngân hàng gien như GenBank, DDBJ, EMBL đã được xây
dựng.
2.4.1.4. Lưu giữ 2 lồi VTB
Hình 2.3. Sơ đồ khối lưu giữ VTB