- Chi Tetraselmis
c. Lưu giữ, bảo quản giống ở nhiệt độ thấp
Ưu điểm của phương pháp lưu giữ giống ở nhiệt độ thấp (-80°C) có sử dụng
chất bảo quản (Cryoprotectants agent – CPAs) là DMSO, glycerol…: đảm bảo là mẫu không bị nhiễm vi khuẩn, hoặc tránh khả năng có thể bị mất giống, hình dạng tế bào ln ổn định, bảo tồn được sự đa dạng di truyền của nguồn gen, khả năng phục hồi cao và tiết kiệm chi phí, thời gian lưu giữ giống tảo ở -80°C có thể kéo dài từ 6 tháng đến
vài năm.
Sơ đồ thí nghiệm bảo quản các lồi VTB quang tự dưỡng ở nhiệt độ - 80°C có sử dụng chất bảo quản là DMSO hoặc glycerol được chỉ ra trên hình 2.4. Thí nghiệm
được chia thành 2 lơ: lơ đối chứng (ĐC) và lơ thí nghiệm (TN). Ở lơ ĐC: có 3 cơng
thức là ĐC (+), ĐC (-)1 và ĐC (-) 2.
ĐC (+): Mẫu nuôi ở điều kiện nuôi cấy tối ưu (môi trường F/2 hoặc Walne hoặc Erd… có độ mặn 30‰, ở 30°C, chiếu ánh sáng 100 mol/m2/s, pH 7), mục đích để
xác định sinh trưởng của tảo trong điều kiện không làm lạnh, không sử dụng chất bảo quản;
ĐC (-) 1: Mẫu có bổ sung các chất bảo quản với nồng độ khác nhau, khơng đưa
vào -80°C với mục đích để xác định ảnh hưởng của nồng độ chất bảo quản đến sinh
trưởng của tảo;
ĐC (-) 2: Mẫu không bổ sung chất bảo quản, đưa vào -80°C nhằm mục đích xác định được khả năng sống sót tự nhiên của tế bào tảo.
Ở lô TN: mẫu được bổ sung chất bảo quản với nồng độ tối ưu, đưa vào -80°C
trong 48 giờ. Mục đích để xác định khả năng sống sót của tế bào tảo khi sử dụng chất bảo quản và được lưu giữ ở âm 800C.
Với các chất bảo quản nêu trên, thời gian bảo quản sau 48 giờ trong âm 800C hay 6 tháng hoặc 1-2 năm thì tảo đều có tỷ lệ sống sót (= số tế bào phục hồi/tổng số tế bào) cao, hình thái tế bào giữ nguyên, màng tế bào nguyên vẹn, tế bào khơng bị vón, khơng nhiễm khuẩn và khi đưa vào điều kiện bình thường thì dịch ni cấy ở dạng huyền phù không bị bám đáy.
Mẫu sau khi được bổ sung chất bảo quản được đưa vào tủ -80°C trong 48 giờ theo quy trình làm lạnh (-1C/phút) có sử dụng isopropanol. Sau 2 -3 tiếng, các ống giống được lấy ra khỏi dung dịch isopropanol và đặt trực tiếp vào tủ -80oC để bảo
quản giống. Sau 2 ngày bảo quản, mẫu được hoạt hóa trở lại ở nhiệt độ phòng và kiểm
tra sinh trưởng bằng cách đếm MĐTB cứ 2 ngày/lần hoặc đo mật độ quang ở bước sóng 680 nm (OD680) trong 30 ngày kể từ khi hoạt hóa trở lại.
Hoạt hóa mẫu trở lại nhiệt độ phòng: Sau một thời gian bảo quản mẫu ở nhiệt
độ -800C, mẫu được lấy ra và làm tan từ từ trong bể ổn nhiệt ở 300C trong 30 phút cho tới khi dịch tế bào đồng nhất. Sau đó, ly tâm dịch tế bào với tốc độ 5.000 vòng/phút, 40C trong 5 phút. Loại bỏ dịch và thu cặn. Do màng tế bào rất dễ bị tổn thương do có sự chênh lệch lớn về nhiệt độ, vì vậy, mọi thao tác ở giai đoạn này cần nhẹ nhàng,
tránh va đập mạnh. Rửa cặn tế bào thu được bằng nước biển khử trùng có độ mặn
30‰ nhằm loại bỏ hết chất bảo quản thừa có trong mẫu. Hịa tan cặn tế bào trở lại bằng mơi trường f/2 có độ mặn 30‰ tương ứng với thể tích ban đầu và mẫu được ni trong các ống nghiệm ở điều kiện: nhiệt độ từ 24-260C, ánh sáng yếu (10-20
Đối chứng (-) 2
Mẫu không sử dụng CPAs
được đưa vào - 80C để xác định khả năng sống sót tự
nhiên của mẫu.
Đối chứng (-) 1
Mẫu có sử dụng CPAs ở các nồng độ khác nhau đặt
ở điều kiện ni cấy tối ưu (khơng đưa vào - 80C).
Hình 2.4. Sơ đồ thí nghiệm ảnh hưởng của chất bảo quản lên khả năng sống sót của tảo được lưu giữ ở - 800C
Đối chứng(+)
Mẫu không sử dụng CPAs, nuôi
ở điều kiện nuôi cấy tối ưu.
Lơ thí nghiệm
Mẫu có sử dụng CPAs ở các
nồng độ khác nhau được đưa vào - 80C trong 48 giờ.
Đưa vào tủ -80C trong 48 giờ nhờ sử dụng quy trình
làm lạnh (-1C/phút) có sử dụng isopropanol.
Hoạt hố mẫu trở lại ở nhiệt độ phòng. Kiểm tra sinh trưởng của tảo bằng cách đo OD680 hoặc đếm MĐTB (2 ngày/lần) trong vịng 30 ngày ni cấy
Sinh trưởng của mẫu tảo sau khi hoạt hóa lại ở nhiệt độ phịng được xác định
thơng qua đo OD680 hoặc đếm MĐTB (triệu tế bào/ml). Theo dõi sinh trưởng của tảo
sau 30 ngày kể từ ngày hoạt hóa với tần suất lấy mẫu để đo các thông số nêu trên là 2 ngày/lần. Tỷ lệ sống sót của mẫu được xác định theo công thức = Số lượng tế bào đếm
được sau khi hoạt hóa/ Số lượng tế bào ban đầu.
2.4.2. Xác định điều kiện ni cấy thích hợp 2 loài VTB thuộc 2 chi
Chaetoceros và Tetraselmis
Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp của 2 lồi VTB được chỉ ra trên hình 2.5
Hình 2.5. Sơ đồ khối xác định điều kiện ni cấy thích hợp của VTB
Để xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho 2 loài VTB thuộc 2 chi
Chaetoceros và Tetraselmis, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện
nuôi như: môi trường dinh dưỡng (Walne, f/2 và Erd), nồng độ muối (dao động từ 2 - 70‰), nhiệt độ (15 - 400C), ánh sáng (60 - 800 mol/m2/s), pH (3 - 11) lên sinh trưởng và phát triển của 2 loài VTB trên (với chu kỳ sáng tối là 12:12h) [47].
Nhằm mục đích xác định các điều kiện ni cấy tối ưu cho các lồi VTB phân lập được từ vùng biển của Việt Nam hiện đang được sử dụng phổ biến tại các trại
Tảo giống thuần chủng
Nuôi trong các điều kiện khác nhau
Môi trường dinh dưỡng (Walne, F/2 và Erd) Nồng độ muối (5, 10, 20, 30, 40, 50‰) Cường độ chiếu sáng (60, 100, 200, 400, 600 và 800 mol/m2s) Nhiệt độ (20, 25, 30 và 37°C) pH (6, 6,7-7, 8 và 10)
Xác định sinh trưởng của các lồi VTB thơng qua các
thông số như mật độ quang OD680, mật độ tế bào, trọng
lượng khô, hàm lượng sắc tố (chlorophyll a và carotenoit)
NTTS ở các tỉnh phía Bắc nên 3 mơi trường dinh dưỡng phổ biến (do hố chất dễ tìm, rẻ và dễ pha, khơng địi hỏi kỹ thuật cao cho người chuẩn bị mơi trường) đã được lựa
chọn. Ngồi ra, các giới hạn trên và dưới của các yếu tố môi trường khác rất gần với cả
điều kiện phịng thí nghiệm và điều kiện các trại NTTS như về nhiệt độ, độ mặn, pH, cường độ ánh sáng và khả năng tự thích nghi dần và cao với điều kiện ngoại cảnh khi
chuyển các loài tảo nêu trên từ điều kiện phịng thí nghiệm xuống ni trồng ở các trại cũng đã được tính đến trong việc lực chọn loài VTB. Do vậy, khă năng các loài VTB quang tự dưỡng thích nghi được với biến động rộng của các yếu tố môi trường được quan tâm đầu tiên.
2.4.2.1. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng: Thí nghiệm được tiến hành
với 3 môi trường dinh dưỡng f/2, Erd và Walne có nồng độ muối 30‰, cường độ chiếu sáng 100 mol/m2/s, nhiệt độ 28°C - 30°C, pH 7.
2.4.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ muối: Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của
nồng độ muối được tiến hành với dải nồng độ 5, 10, 20, 30, 40, 50‰ được điều chỉnh bởi muối NaCl và nước cất 2 lần. Giữ nguyên các điều kiện nuôi cấy như: môi trường
dinh dưỡng tối ưu, cường độ chiếu sáng 100 mol/m2/s, 30°C, pH 7.
2.4.2.3. Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng: Thí nghiệm nghiên cứu ảnh
hưởng của cường độ chiếu sáng lên sinh trưởng của tảo được tiến hành với dải cường độ 60, 100, 200, 400, 600 và 800 mol/m2/s được đo bằng thiết bị đo cường độ chiếu sáng (Lux Lighting meter, Nga). Giữ nguyên các điều kiện nuôi cấy: môi trường dinh
dưỡng tối ưu, nồng độ muối 30‰, 30°C, pH 7.
2.4.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ: Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt
độ lên sinh trưởng của tảo được tiến hành với dải nhiệt độ 20, 25, 30 và 37°C. Chế độ
nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau trong thí nghiệm này được tiến hành với các tủ ấm vi sinh (incubator) có hệ thống chiếu sáng. Giữ nguyên các điều kiện nuôi cấy: môi trường dinh dưỡng tối ưu, nồng độ muối 30‰, cường độ chiếu sáng 100 mol/m2/s, pH 7.
2.4.2.5. Ảnh hưởng của pH: Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi
trường lên sinh trưởng được tiến hành với dải pH 6, 6,7-7, 8 và 10 được điều chỉnh bởi
dung dịch NaOH và HCl. Giữ nguyên các điều kiện nuôi cấy: môi trường dinh dưỡng tối ưu, nồng độ muối 30‰, cường độ chiếu sáng 100 mol/m2/s, 30°C.
Các thí nghiệm được tiến hành trong các bình tam giác 250 ml có chứa 150 ml dịch tảo, lặp lại 2 lần/ công thức, duy trì 25-30 ngày với tần suất lấy mẫu 3-5 ngày/lần,
lượng mẫu: 20 ml/lần.
2.4.2.6. Xác định sinh trưởng của VTB
Sinh trưởng của các loài VTB được đánh giá thông qua các chỉ số: đo OD680
hoặc đếm số lượng tế bào bằng buồng đếm Burker-Turk (Đức), trọng lượng khô (TLK, g/lit) ở các thời điểm nuôi cấy khác nhau, xác định hàm lượng lượng sắc tố chlorophyll a, carotenoit (g/l) và xác định tốc độ sinh trưởng đặc trưng (µ, /ngày).