- Loài Chaetoceros sp.
3.1.3.2.Lưu giữ Chaetoceros gracilis và Tetraselmis chuii ở nhiệt độ thấp (-80ºC)
(-80ºC)
Bên cạnh việc giữ trên môi trường thạch chúng tôi cũng tập trung vào việc lưu giữ ở -800C có sử dụng isopropanol với các chất bảo quản như: DMSO và glycerol. Theo các công bố của Morris (1981) [73], Lee và Soldo (1992) [62] các chất bảo quản
thường được sử dụng cho lưu giữ giống vi tảo như: DMSO, glycerol và methanol nhưng trong số đó, DMSO được sử dụng phổ biến nhất trong việc lưu giữ giống do nó
có một số đặc tính như: có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào cũng như bị loại bỏ ra khỏi tế bào một cách dễ dàng và nhanh hơn so với glycerol và các chất bảo quản khác. Do vậy, chúng cũng làm giảm khả năng lây nhiễm và bùng phát của vi khuẩn trong q trình ni cấy tảo. Chính vì vậy, chúng tơi đã tập trung lưu giữ 2 lồi VTB nói trên
ở -800C có sử dụng chất bảo quản DMSO.
Nồng độ chất bảo quản
Khả năng sống sót của từng tế bào tảo sau khi lưu giữ ở nhiệt độ thấp phụ thuộc rất nhiều vào bản chất và nồng độ của chất bảo quản. Trong thí nghiệm này, chúng tơi
đã chọn loài VTB T. chuii để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất bảo quản
DMSO từ 7-25% lên tỷ lệ sống sót của chúng sau thời gian bảo quản ở nhiệt độ thấp. Các tế bào tảo T. chuii sau khi được bổ sung DMSO với các nồng độ tương ứng từ 7-
25% và được đưa vào tủ -800C với sự hỗ trợ của isopropanol (có vai trị giảm -10C /1phút). Các tế bào này sẽ được bảo quản ở -800C trong 12 giờ, sau đó được hoạt
hóa trở lại ở nhiệt độ phịng. Tiếp theo sau, chúng tơi tiến hành đếm các tế bào có khả
năng phục hồi sau 2-5 giờ hoạt hóa và chỉ đếm các tế bào còn giữ nguyên hình thái, khơng bị vỡ và mất sắc tố. Kết quả được chỉ ra ở bảng 3.4 đã cho thấy ở tế bào
Tetraselmis chuii, ở nồng độ 15% DMSO có tỷ lệ sống sót (số lượng tế bào sau khi làm tan/số lượng tế bào ban đầu) của tảo đạt cao nhất, tương ứng với 42,5%, tiếp theo là nồng độ 10% DMSO với tỉ lệ sống sót của tế bào đạt 13,2%. Do vậy, chúng tôi đã chọn nồng độ chất bảo quản 15% DMSO cho các thí nghiệm bảo quản tiếp theo.
Bảng 3.4. Nồng độ DMSO tối ưu cho bảo quản vi tảo biển quang tự dưỡng Tetraselmis
chuii ở nhiệt độ thấp - 800C
STT Nồng độ DMSO (%)
Số lượng tế bào tảo
ban đầu (x 106)
Số lượng tế bào tảo sau khi làm tan (x 106)
Tỷ lệ sống sót của tảo 1 7 2,73 0,21 7,7 2 10 2,73 0,36 13,2 3 15 2,73 1,16 42,5 4 18 2,73 0,29 10,6 5 21 2,73 0,23 8,5 6 25 2,73 0,2 7,3
Với đặc điểm cấu trúc tế bào của loài tảo silic C. gracilis chỉ có một màng tế bào bao bọc nên tế bảo rất dễ bị vỡ khi có sự chênh lệch về nhiệt độ trong q trình bảo quản (Meryman, 1966) [67]. Do vậy, tỷ lệ sống sót của chúng sau 30 ngày hoạt hóa trở lại nhiệt độ phịng đạt được rất là thấp, chỉ dao động từ 0,1% đến 10,0% (bảng 3.5). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi nhận được cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Canavate và Lubian, 1994 [34] công bố về tỉ lệ sống sót của loài C. gracilis đạt được từ 0-17,1% với quy trình làm lạnh 2 bước.
Đối với lồi tảo lục T. chuii được chúng tơi bảo quản ở nhiệt độ -80ºC với sự hỗ
trợ của 15% DMSO trong 48 giờ theo quy trình làm lạnh 1 bước nhờ sử dụng isopropanol (giảm 1ºC/1 phút) và sau 30 ngày hoạt hóa trở lại ở nhiệt độ phịng, chúng cũng chỉ có tỉ lệ sống sót đạt từ 0,1% đến 7%. Mặc dù số lượng các tế bào được hoạt hóa trở lại ở giai đoạn những ngày đầu sau thời gian bảo quản cũng khá là nhiều (như kết quả được chỉ ra ở bảng 3.4, tỷ lệ sống sót sau 2-5 giờ hoạt hóa ở nhiệt độ phịng đạt 42,5%) nhưng sau đó rất nhiều tế bào lại bị vỡ hoặc mất sắc tố và khơng có khả năng hồi phục nên cuối cùng tỷ lệ sống sót sau 30 ngày hoạt hóa trở lại ở nhiệt độ phịng lại cũng đạt rất thấp ở tảo T. chuii.
Các kết quả nghiên cứu của John và cs., 1993 [60] công bố đã cho chúng tôi thấy quy trình làm lạnh (theo 1 hay 2 bước) để đưa mẫu tới nhiệt độ bảo quản có một vai trị rất quan trọng và nó đã ảnh hưởng tới khả năng sống sót và phục hồi của mẫu tảo sau thời gian bảo quản. Theo kết quả nghiên cứu này, lồi T. chuii đã được ni
quy trình làm lạnh 2 bước (giảm 1ºC/1 phút cho tới -30ºC và sau đó đặt trực tiếp mẫu bảo quản trong nitơ lỏng (-196ºC) với chương trình giám sát nhiệt độ được điều khiển bằng chương trình máy tính chuyên dụng, tỷ lệ sống sót của T. chuii có thể đạt đến 28- 40% (John và cs., 1993) [60]. Chính vì vậy, để đảm bảo cho việc bảo quản các chủng giống vi tảo biển ở nhiệt độ thấp là rất tốn kém vì địi hỏi phải có các thiết bị chuyên dụng.
Vì vậy, trong điều kiện trang thiết bị hiện có của phịng thí nghiệm ở Việt Nam,
chúng tôi đưa ra khuyến cáo không nên bảo quản các loài tảo nêu trên ở nhiệt độ thấp
(- 80°C, -20°C) vì tỷ lệ sống sót của tảo đạt được không cao (< 10%). Chúng ta chỉ nên bảo quản chúng ở nhiệt độ phịng (trên mơi trường lỏng và thạch nghiêng hay
thạch ẩm) để vừa có thể lưu giữ giống, không làm mất đi các đặc điểm di truyền quý của nó mà lại phù hợp với trang thiết bị hiện có của phịng thí nghiệm.
Bảng 3.5. Tỷ lệ sống sót của Chaetoceros gracilis và Tetraselmis chuii được lưu giữ ở âm 800C với sự có mặt của 15% DMSO
Lồi VTB Nồng độ chất bảo quản Nhiệt độ bảo quản Tỷ lệ sống sót (%) Nhận xét (sau 30 ngày hoạt hóa trở lại ở nhiệt độ
phịng)
Chaetoceros gracilis 15% DMSO
- 80°C, -20°C -20°C
0,1-10,0 Hầu hết tế bào bị vỡ sau 7 ngày hoạt hóa
Tetraselmis chuii 15% DMSO
- 80°C 0,1-7,0 Hầu hết tế bào bị vỡ sau 10 ngày hoạt hóa