- Chi Tetraselmis
c.Phân tích các thành phần dinh dưỡng khác
Số lượng mẫu tối thiểu cần thiết đủ để phân tích các thành phần dinh dưỡng đối với 2 lồi VTB là 20 g sinh khối tươi.
Hàm lượng protein tổng số được xác định theo phương pháp Kieldal, Nitơ tổng số (%), Xơ (%), gluxit, polyxacharit, tro, ẩm xác định theo phương pháp phân tích AOAC 2000. Các nguyên tố B (mg/kg), I (mg/kg) được phân tích theo phương pháp
đo quang phổ tử ngoại UV-Vis (Ultraviolet-visible spectroscopy). Mn (mg/kg), Co
(mg/kg), Mo (mg/kg), K (%), Na (%), Mg (%), Ca (%), Zn (mg/kg), Fe (mg/kg), Cu (mg/kg), Pb (mg/kg), Cd (mg/kg), Cr (mg/kg), Sr (mg/kg), Hg (mg/kg), As (mg/kg)
được phân tích theo phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử AAS (Atomic Absorption
Spectrophotometric) (Horwitz, 2000) [55].
Phương pháp thu và xử lý số liệu:
Các chỉ số thống kê (giá trị trung bình, độ lệch chuẩn) và phân tích phương sai
được xử lý bằng chương trình Data Analysis trong Excel 2003.
Số liệu được xử lý thống kê theo ANOVA ở mức độ sai khác có ý nghĩa
P ≤ 0,05.
Sử dụng Chương trình phần mềm MapInfo Professional Version 7.5 để xác định kích thước của tế bào.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập, lưu giữ và định tên khoa học 2 loài VTB thuộc 2 chi
Chaetoceros và Tetraselmis
3.1.1. Thu thập và phân lập 2 loài VTB 3.1.1.1. Loài Chaetoceros sp. 3.1.1.1. Loài Chaetoceros sp.
Sau 20 ngày nuôi cấy trên môi trường Erdschreiber (Erd) lỏng, chúng tôi đã
quan sát được các tế bào tảo Chaetoceros sp. phát triển được bằng cách pha loãng ở
nồng độ từ 10-7 đến nồng độ 10-10 . Sau khi quan sát dưới kính hiển vi quang học các tế bào phát triển ở các nồng độ nói trên, chúng tơi tiến hành lặp lại q trình pha lỗng lần thứ 2, thứ 3… cho tới khi đảm bảo các dòng tế bào thuần thu được ở các nồng độ pha loãng khác nhau đều được phát triển từ 1 tế bào và thích nghi với điều kiện phịng thí nghiệm. Các dịng tế bào thuần sau khi phân lập được ni trong mơi trường có bổ sung hỗn hợp kháng sinh Ampicillin (250 mg/l), Kanamycin (100 mg/l), Streptomycin
(50 mg/l), Gentamycin (50 mg/l) để loại bỏ vi khuẩn nhiễm trong mẫu. Kết quả sau 2
tháng phân lập và nuôi cấy trên môi trường Erd lỏng, chúng tơi đã phân lập được dịng tế bào Chaetoceros sp. từ vùng biển Khánh Hồ. Quan sát dưới kính hiển vi quang học
ở độ phóng đại 1500 lần, tế bào VTB Chaetoceros sp. có các đặc điểm như sau: Tế bào hình chữ nhật, vng, có 4 lơng gai ở các góc của tế bào, kích thước: dài 10,1 ± 2,9 m, rộng 6,4 ± 1,4 m, màu vàng nâu (hình 3.1). Dựa theo khoá phân loại của
Ehrenberg, 1844 [91] và Trương Ngọc An, 1993 [1] về các đặc điểm hình thái của các lồi thuộc chi Chaetoceros, theo khóa phân loại của Pantocsek, 1982 [92] về đặc điểm hình thái của lồi Chaetoceros gracilis, kết hợp với kết quả chụp ảnh dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử quét (SEM; hình 3.2) chúng tơi nhận định lồi
Chaetoceros sp. phân lập từ vùng biển Khánh Hồ có thể là loài C. gracilis Pantocsek 1982.
3.1.1.2. Loài Tetraselmis sp.
Sau 2 tuần cấy trải trên môi trường thạch, chúng tôi đã quan sát được các khuẩn lạc của tế bào tảo mọc riêng rẽ và trải đều trên bề mặt thạch. Quan sát dưới kính hiển vi quang học, chúng tôi chọn các dịng tế bào có dạng đơn bào màu xanh, có 4 roi, dạng hình cầu để tiếp tục cấy ria trên bề mặt thạch với mục đích là thu được các tế bào dòng thuần. Lặp lại quá trình cấy chuyển trên bề mặt thạch từ 2-3 lần, đảm bảo thu
được các dịng tế bào thuần, khơng bị nhiễm nấm và vi khuẩn. Sau đó, từng tế bào mọc
riêng rẽ trên bề mặt thạch này sẽ được nuôi trở lại trên môi trường Erd lỏng để lưu giữ giống và nuôi thu sinh khối phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả sau 6 tuần phân lập trên môi trường thạch, chúng tôi đã thu được một số dịng tế bào vi tảo có một số đặc điểm như sau: tế bào có dạng đơn bào, có khả năng chuyển động nhờ bốn roi, tế bào màu xanh, hình cầu, có đường kính 6,2 ± 2,9 m
(hình 3.3). Những đặc điểm của dịng tế bào này tương tự như các đặc điểm của các (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
loài VTB thuộc chi Tetraselmis đã được Stein cơng bố năm 1878 [93] và đặc điểm của lồi Tetraselmis chuii đã được Butcher công bố năm 1959 [32]. Tuy nhiên, khi quan sát hình thái duới kính hiển vi điện tử quét (SEM; hình 3.4), sau rất nhiều lần chụp, chúng tôi đã không chụp được ảnh các tế bào có đủ 4 roi. Điều này có thể giải thích là do trong quá trình tạo mẫu để chụp ảnh SEM với việc cố định mẫu bằng glutaradehyde 3% hoặc vị trí chụp ảnh đã làm đứt gẫy hoặc che lấp các roi của loài vi tảo này. Do
vậy, dựa vào kết quả chụp ảnh hình thái dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi
điện tử quét (SEM), loài VTB phân lập từ vùng bờ biển Hải Phịng có thể được xếp
vào loài Tetraselmis sp. và rất giống với đặc điểm hình thái của lồi T. chuii Butcher
1959, nhưng điều này cần phải được khẳng định bằng các phương pháp nghiên cứu Hình 3.2. Hình thái tế bào C. gracilis
dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM)
với độ phóng đại X 3500 lần Hình 3.1: Hình thái tế bào C. gracilis
dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1500X
khác nữa. Đây cũng chính là những điểm hạn chế chính của phương pháp định tên các lồi VTB nếu chỉ dựa trên các đặc điểm hình thái. Chính vì vậy, chúng tơi đã tiến hành
định tên khoa học chính xác bằng cách đọc và so sánh trình tự gen 18S rRNA để
khẳng định mẫu Tetraselmis sp. phân lập từ vùng biển Hải Phịng có phải là mẫu
Tetraselmis chuii Butcher 1959 hay không?.
3.1.2. Định tên khoa học của 2 loài Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp. 3.1.2.1. Tách chiết ADN tổng số 3.1.2.1. Tách chiết ADN tổng số
ADN tổng số của loài Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp. được tách chiết theo
phương pháp của Đặng Diễm Hồng và cs., 2002 [12]. Kết quả điện di trên gel agarose 1% và đo ở bước sóng 260 và 280nm cho chúng tôi thấy ADN tổng số của loài
Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp. thu được là một băng sáng gọn, khơng bị đứt gãy,
có kích thước tương ứng khoảng 21kb, đảm bảo chất lượng sạch và được sử dụng cho
các thí nghiệm tiếp theo. Kết quả tách ADN tổng số của loài Chaetoceros sp. và
Tetraselmis sp. được trình bày ở hình 3.5.
Hình 3.5: Kết quả tách ADN tổng số của loài
Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp.
Giếng 1: Thang ADN chuẩn 1 Kb Plus Ladder. Giếng 2: ADN tổng số của loài Chaetoceros sp. Giếng 3: ADN tổng số của loài Tetraselmis sp.
21Kb M 1 2
Hình 3.3. Hình thái tế bào Tetraselmis sp. dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại X 1500 lần
x1500
Hình 3.4. Hình thái tế bào Tetraselmis sp. dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM) với độ phóng
đại X 7500 lần
3.1.2.2. Kết quả nhân gen 18S rRNA của loài Chaetoceros sp. và
Tetraselmis sp.
Dựa trên trình tự của gen 18S rRNA của các loài thuộc chi Chaetoceros và Tetraselmis, chúng tôi đã dùng cặp mồi đặc hiệu UPro18F và U18R do Phịng Cơng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học tự thiết kế để nhân đoạn gen 18S rRNA của loài
Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp. với kích thước tương ứng khoảng 1100 bp. Kết quả
được chỉ ra trên hình 3.6 cho thấy, sản phẩm PCR tương đối đặc hiệu và có kích thước đúng như dự kiến.
3.1.2.3. Tách dòng đoạn gien 18S rRNA của mẫu Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp. Tetraselmis sp.
Để tiến hành tách dịng và xác định trình tự nucleotit một phần gen 18S rRNA
của loài Chaetoceros sp. và Tetraselmis sp. nghiên cứu, chúng tôi đã tiến hành thôi
gen và tinh sạch sản phẩm PCR nhờ sử dụng kit Centrifuge (hãng Promega-Mỹ). Sau
đó sản phẩm PCR tinh sạch sẽ được tách dòng trong vectơ tách dòng pJET1
(Fermentas, Mỹ). ADN - plasmid của các dòng tế bào mang vectơ tái tổ hợp này được tách chiết và được tinh sạch qua cột GFX TM Micro Plasmid Prep Kit (hình 3.7). Kết quả nghiên cứu được chỉ ra trên hình 3.7 đã cho thấy, ADN plasmit tái tổ hợp có mang
đoạn gen mong muốn với kích thước tương ứng khoảng 4,2 kb cao hơn so với kích thước của vectơ pJET1 là 3,1 kb. Sau khi đã tinh sạch, ADN plasmit được xác định
trình tự. 1,65kb 1kb 2kb 0,85kb 1 2 3 1,1kb
Hình 3.6: Kết quả nhân một phần gen 18S rRNA của loài
Chaetoceros sp., Tetraselmis sp.
Giếng 1: Thang ADN chuẩn 1 Kb Plus Ladder. Giếng 2: Một phần đoạn gen 18S rRNA của loài Chaetoceros sp. Giếng 3: Một phần đoạn gen 18S rRNA của loài