M Ở ĐẦU
2.2.4. Phân tích các chỉ tiêu của nguyên liệu và sản phẩm
2.2.4.1. Xác định độ ẩm [18]
Nguyên tắc: làm bay hơi hết hơi nước trong thực phẩm. Cân thực phẩm trước
và sau khi sấykhô, từ đó tính ra % nước có trong thực phẩm.
Tiến hành
Cân đĩa đã được sấy khô, cân 10g mẫu đã chuẩn bị sẵn, nghiền nhỏ cho vào đĩa Petri.
Cho tất cả vào tủ sấy 100–105oC, sấy khô đến trọng lượng không đổi, thường khoảng 6 giờ.
Sấy xong, làm nguội ở bình hút ẩm (25 – 30 phút), đem cân ở cân phân tích.
Tính kết quả
Độ ẩm % X được xác định theo công thức X=(𝐺1−𝐺2)×100
(𝐺1−𝐺2)
Trong đó: G-trọng lượng đĩa Petri (g)
G1: trọng lượng đĩa Petri và trọng lượng mẫu thử trước khi sấy (g) G2: trọng lượng đĩa Petri và trọng lượng mẫu thử sau khi sấy (g)
2.2.4.2. Xác định hàm lượng Nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl [8], [18]
Nguyên tắc: chất đạm khi đem vô cơ hóa sẽ chuyển thành dạng (NH4)2SO4.
Dùng kiềm đặc NaOH đẩy amoniac ra khỏi (NH4)2SO4
(NH4)2SO4+ 2NaOH → 2NH4OH + Na2SO4
Lượng amoniac phóng thích ra được hơi nước lôi cuốn bằng 1 dụng cụ là máy Parnas- Wargner và được dẫn đến 1 bình tam giác có chứa 1 lượng thừa H2SO4
Chuẩn độ lượng H2SO4 còn thừa trong bình hứng bằng NaOH. Từ đây cho phép xác định được lượng amoniac phóng thích ra, có nghĩa là xác định được hàm lượng đạm trong mẫu nguyên liệu.
Cách tiến hành: vô cơ hóa: cân 0,1g mẫu nghiền nhỏ, 1g chất xúc tác vào ống
phá mẫu và thêm 5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc. Nối bộ thu khí, bắt đầu phá mẫu cho đến khi dung dịch trong bình trong suốt hoặc trong xanh (khoảng 2-3giờ), ngừng đun để nguội. Bổ sung 50ml nước cất, lắc đều.
Chưng cất
Lắp ống phá mẫu vào máy chưng cất, bổ sung 10ml NaOH đậm đặc. Khởi động quá trình chưng cất, dịch chưng cất sẽ được chuyển sang bình tam giác 250ml có chứa sẵn 10ml dung dịch H2SO4 0,01N, thêm 5 giọt metyl đỏ.
Ngưng chưng cất khi dịch chưng cất không còn NH3 (thử bằng giấy đo pH). Chuẩn độ lượng thừa H2SO4 bằng NaOH 0,01N. Ngưng chuẩn độ khi dung dịch chuyển từ đỏ sang vàng nhạt
Tính kết quả
Gọi V0 là trị số trung bình của 2 lần thử không (thay mẫu bằng nước cất) Vt là trị số trung bình của 3 lần thử thật
ΔV= V0-Vt là lượng NaOH tương ứng với NH3 phóng thích bởi 10ml dung dịch đạm đã được vô cơ hóa và pha loãng
Nếu nguyên liệu là chất rắn:
%N (hay của N/100g mẫu) = (14 x ΔV x X x10-4 x100)/m Nếu nguyên liệu là chất lỏng:
gN/l = (14 x ΔV x X x 10-4 x 1000)/Vmẫu Trong đó: m- trọng lượng mẫu đem vô cơ hóa (g)
Vmẫu- thể tích mẫu đem vô cơ hóa
2.2.4.3. Xác định hàm lượng Nitơ formol (Nformol) theo phương pháp Sorensen [8]
Nguyên tắc: khi cho các phân tử phi protein tác dụng với formol, sẽ tác dụng
lên nhóm –NH2 để tạo thành phức chất metylen (-N=NH2).
Do vậy, sản phẩm là hợp chất metylen và 1 nhóm chức –COOH tự do hoặc HCl có tính acid, có thể định lượng bằng NaOH với phenolphtalein làm chỉ thị màu, từ lượng NaOH chuẩn độ cho phép xác định 1 cách gián tiếp được lượng Nformol
Cách tiến hành
Trung hòa formol ½ : lấy 50ml formol ½ thêm vào vài giọt phenolphatalein 3%, cho NaOH 0.1N từng giọt tới khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt, ta được formol trung hòa ½
Hút 10ml dung dịch nguyên liệu đã pha loãng 20 lần, thêm vào 10ml dung dịch formol ½ đã trung hòa và vài giọt phenolphatalein 3%, lắc đều để phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau đó định lượng bẳng NaOH 0,1N cho đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng.
Thực hiện 3 lần thử thật và 3 lần thử không
Tính kết quả
Số g Nformol có trong 1 lít nguyên liệu
Trong đó
V0: thể tích dung dịch NaOH 0,1N trung bình của 3 lần thử không Vt : thể tích dung dịch NaOH 0,1N trung bình của 3 lần thử thật ΔV= Vt – Vo: Lượng NaOH cần để trung hòa nhóm –COOH. 20: độ pha loãng của dịch thủy phân
10: thể tích dịch thủy phân đã pha loãng để xác định (ml) 0,0014: số gam Nitơ tương ứng với 1ml dung dịch NaOH 0,1N 1000: hệ số tính ra g/l
2.2.4.4. Xác định hàm lượng nitơ amoniac (Namoniac) theo phương pháp chưng cất
[8]
Nguyên tắc: trong nguyên liệu chứa đạm thường có 1 loại đạm ở dạng vô cơ
(muối amonium hay những amin dễ bay hơi). Đây là dạng đạm tạo thành do sự phân hủy của protein (bị lên men thối hoặc quá trình khử carboxyl).
Những loại đạm này thường có tính kiềm yếu, vì vậy khi cho tác dụng với MgO sẽ bị đuổi ra khỏi dung dịch, do đó chúng sẽ được lôi cuốn theo hơi nước qua 1 bình đựng lượng thừa acid. Sau đó đem định lượng acid dư, suy ra xác định được loại đạm này.
2(NH4)+ + Mg(OH)2 → 2NH3+2H2O+Mg2+ 2NH3+ H2SO4 → (NH4)2SO4
Cách tiến hành
Lấy 50ml nguyên liệu đã pha loãng 20 lần cho vào trong bình cầu
Thêm vào bình cầu 20ml nước cất, vài giọt phenolphtalein và bột MgO đến khi dung dịch trong bình có màu hồng nhạt
Đậy nút ngay tránh khí amoniac bay ra, lắc đều, đun sôi và hơi nước được chưng cất sang 1 bình tam giác có chứa sẵn H2SO4 0,1N; thêm thuốc thử Tashino. Đầu nhọn của ống sinh hàn nhúng chìm trong dung dịch H2SO4 0,1N.
Chưng cất trong 15- 20 phút kể từ khi dung dịch trong bình bắt đầu sôi. Sau 15- 20 phút, chất đạm amoniac sẽ được hấp thụ vào dung dịch H2SO4.
Định phân lượng lượng acid dư bằng NaOH 0,1N cho đến khi dung dịch chuyển từ màu đỏ sang vàng. Thực hiện 3 lần thử thật và 3 lần thử không.
Tính kết quả
Số g Namoniac có trong 100g mẫu X=ΔV x 0,0014 x100 (g/100g) Trong đó
V0: thể tích dung dịch NaOH 0,1N trung bình của 3 lần thử không (ml) ΔV=V0 – Vt: lượng NaOH tương đương với lượng đạm phóng thích đã được hấp thụ trong H2SO4
Vt: thể tích dung dịch NaOH trung bình của 3 lần thử thật (ml)
2.2.4.5. Xác định hàm lượng calci [8]
Nguyên tắc: dùng EDTA xác định calci trong dung dịch với chỉ thị murexid
(C8H5O6N5) trong môi trường có pH 12. Kí hiệu chất chỉ thị murexid là H3I trong môi trường pH 12 H3I có màu tím khi kết hợp với calci tạo thành chất phức tạp có màu hồng.
H3I (tím) + Ca2+<-> CaH3I ( hồng)
Chất phức hợp của Ca2+với murexid không bền bằng phức chất tạo bởi Ca2+ và EDTA. Vì vậy EDTA bị đẩy ra khỏi chất phức tạp dưới dạng tự do có màu tím.
CaH3I + H2Y2- (hồng) <-> CaY2- (tím) + H3I- + 2H+ Hóa chất
Dung dịch NaOH 10%
Dung dịch KCN 3%
Chỉ thị murexid: cân 0,1g murexid + 50g NaCl tinh khiết.Nghiền nhuyễn bằng cối, cho vào chai thủy tinh có nắp đậy kín.
Dung dịch EDTA 0,02N
Xử lý mẫu: cua rửa sạch, hấp chín, xay, tách lấy vỏ, rửa sạch. Sấy khô, đặt vào bình hút ẩm. Cân mẫu, hòa tan mẫu bằng HCl đậm đặc, định mức 100ml.
Hút 10ml mẫu đã xử lý, cho vào bình tam giác 100ml. Thêm 2-4ml dung dịch NaOH 10% cho đến khi đạt pH 12 – 13, nhỏ 5 giọt KCN 3% và khoảng nửa hạt gạo
chỉ thị murexid. Chuẩn độ bằng EDTA 0,02N cho đến khi màu hồng của dung dịch chuyển sang màu tím, cần thực hiện song song thí nghiệm đối chứng (thay mẫu bằng nước cất).
• Xác định hàm lượng calci trong 100g mẫu khô Lượng calci trong 100g mẫu khô tính bằng công thức m=𝑣×𝐶×20,04×100
𝑎
Trong đó: m: hàm lượng calci tính bằng mg v: thể tích EDTA dùng để chuẩn độ
C: độ nguyên chuẩn của EDTA 20,04: đương lượng của calci
a: trọng lượng mẫu khô tương đương với thể tích mẫu lấy đi chuẩn độ • Xác định hàm lượng calci hòa tan (Ca2+
) trong dịch lên men
Hút 1ml dịch lên men đã ly tâm, thêm 20ml nước cất, cho vào bình tam giác
100ml. Thêm 2ml dung dịch NaOH 10%, 5 giọt KCN 3% và khoảng nửa hạt gạo
chỉ thị murexid. Chuẩn độ bằng EDTA 0,02N cho đến khi màu hồng của dung dịch chuyển sang màu tím, cần thực hiện song song một thử không.
Tính kết quả
Hàm lượng (g/l) Ca2+
trong mẫu:CCa2+ = 𝐶×𝑣×20,04 𝑉
Trong đó: CCa2+ hàm lượng calci hòa tan g/l V: thể tích dung dịch mẫu lấy đi chuẩn độ v: thể tích EDTA dùng để chuẩn độ
C: độ nguyên chuẩn của EDTA 20,04: đương lượng của calci
2.2.4.6. Xác định hàm lượng glucosamine tạo thành (phương pháp Elson- Morgan) [8] Morgan) [8]
Nguyên tắc: phương pháp này dựa trên sự hình thành các dẫn xuất pyrrol khi
glucosamine được đun nóng trong thuốc thử acetyl aceton. Những pyrrol này sẽ cho phản ứng màu khi tác dụng với thuốc thử Erlich.
Tiến hành
Dựng đường chuẩn glucosamine như mục 2.2.2.1.
Từ đường chuẩn glucosamine sẽ cho biết được mối tương qua giữa nồng độ glucosamine trong đường chuẩn và giá trị OD đo được. Suy ra hàm lượng glucosamine
Chọn các ống nghiệm có cùng kích cỡ và độ dày
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch thí nghiệm,1 ml thuốc thử aceton Lắc đều, đun cách thủy ở 1000
C trong 1 giờ, làm lạnh dưới dòng nước. Thêm 1ml thuốc thử Erlich, lắc đều, đun cách thủy 700C, để nguội, đo OD ở λ=512nm
2.2.4.7. Phương pháp kiểm tra an toàn vệ sinh thực phẩm
Gửi mẫu nguyên liệu đã xử lý bằng phức hệ vi sinh vật đến Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm TP. Hồ Chí Minh
2.2.4.8. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả thí nghiệm được lặp 3 lần và sử dụng các công thức tính toán ± sai số có trong chương trình Excel 2007.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Kết quả quan sát hình thái, đặc điểm sinh học của các vi sinh vật
3.1.1. Bacillus amyloliquefaciens 3.1.1.1. Hình thái 3.1.1.1. Hình thái
Hình 3.1a. Hình thái đại thể Hình 3.1b. Hình thái vi thể (X100) Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái B.amyloliquefaciens
Hình dạng khuẩn lạc To, bám chắc vào mặt thạch, bề mặt nhăn, khô, màu trắng đục.
Hình dạng tế bào Hình que, đứng riêng rẽ
Kích thước tế bào ~1- 1,5 x 0,5µm
Nhuộm gram Gram (+)
3.1.1.2. Đặc điểm sinh học
Khả năng phân giải casein
Hình 3.2. Vòng phân giải casein của B.amyloliquefaciens
Protease do B.amyloliquefaciens tiết
ra, phân giải casein thành các
polypeptide không bắt màu với thuốc thử. Do đó tạo vòng phân giải trong suốt quanh lỗ thạch.
3.1.2. Lactobacillus casei 3.1.2.1. Hình thái 3.1.2.1. Hình thái
Hình 3.3a. Hình thái đại thể L.casei Hình 3.3b. Hình thái vi thể L.casei (X100)
Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái L.casei
Hình dạng khuẩn lạc Tròn, bóng, mép phẳng, màu trắng đục
Hình dạng tế bào Hình que, đứng riêng rẽ
Kích thước tế bào ~1 x 0,5µm
Nhuộm Gram Gram (+)
3.1.2.2. Đặc điểm sinh học
Khả năng làm đông tụ sữa
(+): có hiện tượng đông tụ sữa khi cấy
L.casei vào MT sữa đậu nành sau 24 giờ
(-): sữa đậu nành hấp tiệt trùng không cấy
L.casei
Hình 3.4. Khả năng làm đông tụ sữa của L.casei
+
Kết quả định tính acid tạo ra bởi L.casei
Ống 1: 3ml MT +1 ml thuốc thử Ufermen Ống 2:3ml dịch lên men+1ml thuốc thử Ufermen
Ống 3: 3ml acid lactic 98%+1ml thuốc thử Ufermen
Hình 3.5. Khả năng làm đổi màu thuốc thử Ufermen của L.casei 3.1.3. Aspergillus niger
3.1.3.1. Hình thái
Hình 3.6a. Hình thái đại thể Hình 3.6b. Hình thái vi thể (X60) Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái A.niger
Hình dạng đại thể
Khuẩn lạc tròn, màu trắng. Bào tử khi còn non có màu trắng, về già chuyển sang màu đen
Hình dạng vi thể
Khối bào tử trần, hình tia tỏa tròn. Cuống sinh bào tử không phân nhánh, đầu phình to thành bọng ngắn.
3.1.3.2. Đặc điểm sinh học
Khả năng phân giải huyền phù chitin
1 2 3
Hình 3.7. Vòng phân giải huyền phù chitin
Chitinase do A.niger sinh ra có khả năng phân giải chitin huyền phù. khi nhỏ thuốc thử Lugol vào, phần chưa bị phân giải tạo màu nâu đỏ, phần bị phân giải tạo vòng tròn vô sắc quanh lỗ
3.2. Kết quả định lượng hệ enzyme của các vi sinh vật
3.2.1. Kết quả khảo sát hoạt độ chitinase của A.niger theo thời gian nuôi cấy
Thí nghiệm được tiến hành với mục đích xác định thời gian để thu chitinase có hoạt độ cao nhất, tại các thời điểm 24 giờ, 32 giờ, 40 giờ, 48 giờ, 56 giờ, 64 giờ, 72 giờ với điều kiện nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, thể tích canh trường nuôi cấy là 100ml MT1/bình tam giác 250ml, lắc 150 vòng/phút. Pha loãng dịch enzyme 10 lần trước khi xác định hoạt độ, hoạt độ chitinase được xác định theo mục 2.2.2.1. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4
Bảng 3.4. Hoạt độ chitinase của A.niger theo thời gian
Thời gian nuôi cấy (giờ) ΔOD <512nm> Lượng glucosamine tạo thành (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/ml MT) 24 0,012 3,523 0,18±0,047 32 0,021 6,166 0,31±0,045 40 0,028 8,221 0,41±0,044 48 0,039 11,451 0,55±0,060 56 0,043 12,626 0,63±0,059 64 0,030 8,808 0,45±0,047 72 0,022 6,460 0,33±0,029
Đồ thị 3.1. Hoạt độ chitinase của A.niger theo thời gian nuôi cấy
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 24 32 40 48 56 64 72 Ho ạt đ ộ c hi tin as e ( U I/ m l M T)
Qua bảng 3.4 và đồ thị 3.1 cho thấy hoạt độ chitinase của A.niger từ 24 giờ nuôi cấy có sự thay đổi rõ rệt, tăng cao nhất ở 56 giờ nuôi cấy đạt 0,63 (UI/mlMT) sau đó hoạt độ giảm dần theo thời gian. Hoạt tính enzyme mạnh nhất ở thời điểm bào tử mới bắt đầu hình thành (Lượng, 2006). Kết quả này cho thấy với mỗiloài VSV có giới hạn thời gian thích hợp để sinh tổng hợp enzyme. Ví dụ: kết quả của Lê Thị Huệ (2010) [17] khi nghiên cứu về chủng Aspegillus sp. sinh chitinase có hoạt độ cao nhất khi nuôi cấy 72 giờ. Tuy nhiên lại khác với kết quả của Brazeinska MS (2012) [40] khi nghiên cứu về chủng A.niger LOCK 62 tổng hợp chitinase đạt hoạt độ cao nhất khi nuôi cấy ở 144 giờ.
Chọn thời gian thích hợp để A.niger tổng hợp chitinase là 56 giờ để bố trí các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2. Kết quả khảo sát hoạt độ chitinase của A.niger theo nhiệt độ môi trường
Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến khả năng tổng hợp enzyme của VSV, nhiệt độ quá cao hay quá thấp sẽ làm giảm hiệu suất tổng hợp enzyme. Do đó, tiến hành thí nghiệm xác định nhiệt độ phù hợp nhất để A.niger tổng hợp chitinase có hoạt độ cao nhất. Chuẩn bị 100ml MT1/bình tam giác 250ml, đặt ở các nhiệt độ 200C. 250C, 300C, 350C, 400C, 450C, lắc 150 vòng/phút. Thu dịch enzyme thô dựa vào thời gian tốt nhất đã khảo sát ở mục 3.2.1 là 56 giờ. Xác định hoạt độ chitinase theo phương pháp ở mục 2.2.2.1, kết quả được trình bày ở bảng 3.5
Bảng 3.5. Hoạt độ chitinase của A.niger theo nhiệt độ môi trường
Nhiệt độ (0
C) ΔOD <512nm> Lượng glucosamine tạo thành (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/ml MT) 20 0,023 6,851 0,34±0,065 25 0,034 10,08 0,50±0,088 30 0,048 14,094 0,71±0,090 35 0,045 13,311 0,67±0,103 40 0,031 8,613 0,43±0,104 45 0,019 5,579 0,28±0,096
Đồ thị 3.2. Sự biến thiên hoạt độ chitinase theo nhiệt độ môi trường
Kết quả ở bảng 3.5 và đồ thị 3.2 cho thấy khoảng nhiệt độ thích hợp để A.niger
tổng hợp chitinase có hoạt độ cao nhất là từ 250C đến 350
C và tốt nhất là ở nhiệt độ 300C với hoạt độ 0,71 UI/ml MT. Theo Ramesh và Lonsane (1987) chỉ ra rằng nhiệt độ nuôi cấy là một đặc trưng của cơ thể sinh vật và có ảnh hưởng sâu sắc đến sản lượng và thời gian của pha tổng hợp enzyme [13]. Kết quả nàycũng tương đồng với nghiên cứu của Mohamed A. và cộng sự (1992) [57] khi khảo sát nhiệt độ MT nuôi cấy tổng hợp chitinase ở chủng Aspergillus carneus thích hợp nhất ở 300
C.
Chọn nhiệt độ MT là 300C để nuôi cấy A.niger và bố trí các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.3. Kết quả khảo sát hoạt độ chitinase của A.niger theo pH môi trường
pH môi trường có ảnh hưởng quan trọng đến sinh trưởng, trao đổi chất của VSV. Nồng độ ion H+ hay OH- ảnh hưởng trực tiếp lên tế bào hoặc ảnh hưởng gián tiếp do làm thay đổi độ phân ly của các chất trong môi trường, thay đổi pH sẽ ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính enzyme.
Vì vậy, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu ở các giá trị 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 nhằm xác định giá trị pH tốt nhất để tổng hợp chitinase với điều