M Ở ĐẦU
1.4.2.3. Cơ sở hóa sinh của quá trình lên men lactic
Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kị khí đường với sự tích lũy của acid lactic trong môi trường. Có 2 kiểu lên men lactic: lên men đồng hình và lên men dị hình.
Lên men lactic đồng hình: Quá trình lên men tạo sản phẩm chính là acid lactic, lượng acid lactic chiếm 90-98% tổng sản phẩm lên men.
Lên men lactic dị hình: Sản phẩm lên men ngoài acid lactic còn có hàng loạt các sản phẩm khác với tỷ lệ khá cao như acid lactic 40%, ngoài ra còn có các sản phẩm: ethanol, diacetyl, CO2. [14], [20]
Hình 1.8. Sơ đồ chuyển hóa lên men lactic đồng hình và dị hình [71] 1.4.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn L.casei
Nguồn carbon
Nguồn carbon quan trọng cho VK lactic là monosaccharide và disaccharide. Các loại đường cung cấp cho VK lactic sử dụng là: maltose, glucose, galactose, succrose, dextrin, lactose,…[64]
Nguồn nitrogen
Một số các VK lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ. Để đảm bảo cho sự phát triển của vi khuẩn này, chúng phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường.
Nguồn cung cấp nitơ cho VK lactic sử dụng chủ yếu có trong các sản phẩm thủy phân từ thịt, casein, pepton, nấm men thủy phân…[35]
Các muối vô cơ
VK lactic cần nhiều các muối vô cơ cho qua trình hoạt động của mình như Cu2+, Fe2+, K+, Mn2+, Mg2+,… Mn2+ngăn cản quá trình tự phân của tế bào. Đối với Lactobacillus thì Fe2+, Mn2+, Mg2+ có tác động tích cực lên sự phát triển và sinh acid lactic. Ngoài ra, Mg2+ giúp VK sử dụng tốt hơn các loại đường. [35]
Vitamin
Đa số vi khuẩn lactic (đặc biệt là trực khuẩn đồng hình như L.casei) rất kén chọn thành phần dinh dưỡng, chúng chỉ phát triển khi trên môi trường có tương đối đầy đủ các yếu tố dinh dưỡng cần thiết như acid amin, peptide, protein, vitamin nhóm B (B1, B2, B6, PP),…
Ngoài vitamin và acid amin, VK lactic còn có nhu cầu lớn về các hợp chất hữu cơ cho sự phát triển. Đó chính là lý do sử dụng các muối acetat, muối citrate, Tween-80 (một dẫn xuất của acid oleic), trong thành phần môi trường nuôi cấy VK lactic. [35], [64]
Nhiệt độ
Tùy thuộc nhiệt độ tối ưu cho lên men và sinh trưởng, VK lactic chia thành 2 nhóm ưa ấm và ưa nhiệt.
Các loài có nhiệt độ phát triển tối ưu trong khoảng 200
C- 400C được gọi là các loài ưa ấm. Các loài có nhiệt độ phát triển từ 450C- 620C là các loài ưa nhiệt.
Nhiệt độ tối ưu cho L.casei phát triển là 30-350C [20]
Độ pH
Hoạt động của VK lactic, đặc biệt là hệ enzyme của chúng chịu tác động mạnh của pH. Mỗi enzyme đều có vùng pH tối ưu mà tại đó hoạt lực của enzyme là mạnh nhất. Tuy nhiên, pH nội bào của VK lactic lại không tương ứng với pH tối ưu của các enzyme nội bào mà nó chứa. Đa số trực khuẩn lactic có thể phát triển được ở pH = 3,8-4,0. Hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn lactic ở vùng pH = 5,5-6,5. [20], [35]
Chất ức chế
Các chất kháng sinh (peniciline, choloramphenycol,…) có thể ức chế sự sinh trưởng của VK lactic.
Ngoài ra, trong quá trình lên men thì acid lactic được sinh ra, đầu tiên sẽ có tác dụng ức chế các loại vi sinh vật khác. Sau đó, lượng acid tích lũy đủ lớn khoảng 2,2% sẽ ức chế lại VK lactic. Sự acid hóa tế bào chất gây ra sự tích lũy nội bào acid lactic, chính acid lactic là chất ức chế VK lactic
Vì thế acid lactic tạo thành trong quá trình lên men cần được trung hòa liên tục để tối ưu cho sự phát triển nằm trong khoảng pH từ 5,0- 6,5.[10], [35]
1.4.2.5. Các ứng dụng của vi khuẩn lactic và L.casei
Sản xuất acid lactic
Nhu cầu sử dụng acid lactic trên thế giới rất lớn từ 12-15% tổng lượng acid/năm (Akerberg and Zacchi, 2000) và quan trọng đối với ngành công nghiệp thực phẩm (Lượng, 2006), [20], [73]
Vì vậy, việc nghiên cứu tận dụng các loại môi trường rẻ tiền để lên men sản xuất acid lactic rất cần thiết. Một số loại nguyên liệu đã được ứng dụng làm nguyên liệu lên men:
Bảng 1.4. Một số nguyên liệu được dùng để lên men acid lactic [71]
Nguyên liệu Vi sinh vật Acid lactic
(g/l) Nguồn
Rỉ đường L. delbrueckii 107,0 Beunavennature P.
Calabia&cộng sự (2002) Ngũ cốc Enterococcus faecalis RKY1 102,0 Oh & cộng sự (2005) Gỗ L. delbrueckii NRRLB- 445 108,0 Moldes (2001) Cellulose L.coryniformis
ssp.toquen ATTC 2560 24 Miura & cộng sự (2003)
Whey Enterococcus faecalis
RKY1 93 Wee & cộng sự (2004)
Ngoài ra, đã có vài công trình nghiên cứu tận dụng dịch tương đậu nành để làm môi trường lên men lactic.
Dịch tương đậu nành là thành phần nước ép sau quá trình đông tụ sữa trong quy trình sản xuất đậu phụ. Loại nước này thải ra môi trường làm ô nhiễm nguồn nước. Tuy nhiên, dịch tương đậu nành chứa nhiều chất dinh dưỡng còn sót lại của hạt đậu nành. Hackler và cộng sự (1963), đã chỉ ra rằng 16% chất khô và 9% protein đã đi vào dịch tương đậu nành. [45]
Nguyễn Thị Cẩm Vy (2010), đã phân tích thành phần dịch tương đậu nành và được trình bày ở bảng 1.5 như sau:
Bảng 1.5. Thành phần hóa học của dịch tương đậu nành và sữa đậu nành[37]
Thành phần Dịch tương đậu nành Sữa đậu nành
Nitơ tổng (g/l) 2,8 3,6
Lipid % 0,34 0,47
Đường khử (g/l) 1,373 2,0
Protein (g/l) 6,696 6,984
Nitơ formol (g/l) 1,32 1,37
Bên cạnh đó, dịch tương đậu nành chứa nhiều loại acid amin. Xét trong 100g protein của các thành phần thu được trong quá trình làm đậu phụ thì hàm lượng một số loại acid amin có trong dịch tương đậu nành lần lượt là: lysine 8,56g; leucine 3,89g; valine 2,65g… [55]
Các nghiên cứu tận dụng dịch tương đậu nành:
Ben Ounis & cộng sự (2007) sử dụng dịch tương đậu nành đã qua lọc điện thu hồi protein và khoáng chất để nuôi Lactobacillus plantarum LB17. [73]
Vaideki T. S (2005), đã sử dụng màng siêu lọc để thu hồi đường, protein, isoflavine. [73]
Nguyễn Thị Cẩm Vy (2010), đã nghiên cứu chế biến thức uống chức năng từ dịch tương đậu nành và sữa đậu nành. [37]
Vi khuẩn lactic ngoài khả năng lên men lactic, chúng còn có khả năng sản sinh ra các chất kháng sinh gọi là bacteriocin và được ứng dụng nhiều trong bảo quản thực phẩm. [10], [20].
Một số ứng dụng khác
Chế biến thực phẩm: các vi khuẩn lactic được dùng để sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa. Trong sản xuất các loại sữa chua đều có sử dụng quá trình lên men lactic. Nhờ có quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic mà casein được kết tủa, tạo cho sản phẩm có hương vị đặc trưng. Người ta bổ sung calcilactate vào thành phần sữa bột dinh dưỡng, bánh ngọt… để tăng lượng calci cho cơ thể. Trong nông
nghiệp, ứng dụng vi khuẩn lactic để ủ chua thức ăn gia súc do trong quá trình lên men, ngoài sản phẩm acid lactic còn có một số chất có giá trị như chất thơm, vitamin, kháng sinh,…nên thức ăn gia súc ủ chua rất có giá trị về mặt dinh dưỡng, góp phần tăng năng xuất vật nuôi. Sử dụng VK lactic để sản xuất các chế phẩm probiotic, khi đưa probiotic vào đường tiêu hóa của gia súc, gia cầm, các VSV có lợi sẽ nhanh chóng phát triển, nhân nhanh số lượng, tạo môi trường acid ở ruột non và ruột già, tiết ra các chất kháng sinh làm ức chế VSV có hại, hạn chế các bệnh đường ruột. [20]
1.4.3. Vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens 1.4.3.1. Vị trí phân loại 1.4.3.1. Vị trí phân loại Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus
Loài: Bacillus amyloliquefaciens [70]
1.4.3.2. Đặc điểm sinh học
Trực khuẩn nhỏ, thẳng, kích thước 0,5-2,5 x 1,2-10µm, thường xếp thành cặp đôi hay chuỗi ngắn, 2 đầu tế bào tròn hoặc hơi vuông. Bào tử hình bầu dục có kích thước 0,9-0,6µm.
Là trực khuẩn gram dương, catalase dương tính, hiếu khí, khi còn non di động bằng tiêm mao, già tiêm mao rụng nên mất khả năng di động. Khuẩn lạc khô, hoặc nhớt, màu trắng xám hay trắng đục, hơi nhăn có mép lõm mép lồi, tạo thành lớp màng mịn bám chặt trên bề mặt thạch. [36], [70]
1.4.3.3. Khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của B.amyloliquefaciens
Giới thiệu enzyme protease
Protease là các enzym xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (CO-NH) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự.
-CH - C - N -CH - R O H R’ + H2O - CH - C - OH R O + HN - CH - H R’
Nhiều protease có khả năng liên kết este và vận chuyển acid amin.
Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử quốc tế (1984) đã đề nghị sử dụng thuật ngữ peptidase để chỉ các enzym thủy phân mối liên kết peptide (thuộc phân nhóm E.C 3.4) [69]
Nguồn thu nhận protease
Người ta có thể thu nhận protease từ nhiều nguồn khác nhau: động vật, thực vật và vi sinh vật. Vi sinh vật chính là đối tượng có thể sản xuất enzym nói chung và protease nói riêng với số lượng nhiều và giá thành rẻ.
Protease vi sinh vật có thể được thu nhận từ Bacillus subtilis, B.mesentericus,
B.thermorpoteoliticus. Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích
hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu. Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzym được sử dụng. [52], [56]
Protease thu nhận từ nấm mốc: Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng:
A.oryzae, A.terricola, A.fumigates,…các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả
ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Các protease của nấm hoạt động trong vùng pH khá rộng (pH = 4-11) và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất cao.
Protease thu nhận từ xạ khuẩn: người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S.fradiae, S.erythreus,... [23]. Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được tách chiết từ S.grieus, enzym này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid. [56]
1.4.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng-phát triển và tổng hợp protease của B.amyloliquefaciens hợp protease của B.amyloliquefaciens
Nguồn carbon
Nguồn carbon tự nhiên thường dùng trong môi trường nuôi cấy là bột mì, bột đậu tương, cám và nước chiết của chúng. Nồng độ glucid thích hợp tùy thuộc vào bản chất hóa học của chúng và đặc tính sinh lý của VSV. Nồng độ glucid thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp protease cũng thay đổi theo từng loài VSV. Theo
Ostroko và cs (1977), glucose, saccharose, maltose và sorbitol là nguồn carbon tốt nhất cho sự tổng hợp protease ở B.subtilis [36]
Nguồn nitrogen
Nguồn nitơ trong môi trường nuôi cấy VSV có thể là các chất hữu cơ (protein và các sản phẩm thủy phân của protein) hay các muối vô cơ chứa nitơ (amoni, nitrat). Giá trị dinh dưỡng của các nguồn nitơ khác nhau tùy thuộc vào khả năng thu nhận nitơ từ nguồn là NH3. Nguồn nitơ hữu cơ thường ảnh hưởng tốt đến quá trình tổng hợp protease. Vì vậy chúng có vai trò như chất cảm ứng trong quá trình này. Nguồn nitơ hữu cơ thường dùng: pepton, casein, albumin, bột đậu tương,... Nguồn nitơ vô cơ: (NH4)2SO4, các muối clorua, sulphate, nitrate amon. Phối hợp nguồn nitơ hữu cơ và nitơ vô cơ làm tăng đáng kể quá trình tổng hợp protease.
Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzyme của VSV cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp. Tùy từng chủng VSV mà nhiệt độ thích hợp khác nhau: nấm mốc thường phát triển ở nhiệt độ 22-320C, còn VK thì phát triển ở nhiệt độ cao hơn thường là 35-550C. Đa số VSV tổng hợp enzyme không bền với nhiệt độ và bị kìm hãm nhanh chóng khi ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp. [55]
pH môi trường
pH môi trường thường ít bị tác động khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt. Khi dùng phương pháp nuôi cấy bề sâu ( nuôi cấy chìm), pH có ảnh hưởng rất lớn đến sự tích lũy protease trong môi trường. pH của môi trường thay đổi sau khi thanh trùng MT và đặc biệt thay đổi rất lớn trong quá trình nuôi cấy. Trong quá trình nuôi cấy, tùy theo thành phần MT và các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật mà pH của môi trường sẽ chuyển dần về phía acid hay kiềm. Các loài thuộc
giống Bacillus đa số tổng hợp nên protease trung tính và kiềm tính.
B.amyloliquefaciens tổng hợp nên protease trung tính, pH môi trường phù hợp trong
1.4.3.5. Các ứng dụng của B.amyloliquefaciens và protease
Protease từ VSV có giá trị thương mại cao có vai trò nổi bật trong các ngành công nghiệp
Ngành công nghiệp thực phẩm
Trong công nghệ sản xuất các sản phẩm từ sữa nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của protease để sản xuất phomat,…
Trong công nghệ chế biến thịt, đồ hộp: protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có độ mềm thích hợp, có vị tốt hơn.
Trong chế biến thủy sản: từ lâu, người ta đã nghiên cứu và biết được tác dụng của các enzyme tiêu hóa và các enzyme có sẵn trong nguyên liệu có tác động tới quá trình thủy phân protein trong thịt cá để sản xuất nước mắm, sản xuất dịch đạm thủy phân từ các phế liệu giàu protein như thịt vụn, đầu và da cá,…
Trong công nghiệp nhẹ
Sản xuất các chất tẩy rửa, kem đánh răng, bột giặt,…tẩy các vết bẩn có bản chất protein.
Sản xuất sợi tơ tự nhiên: protease có tác dụng thủy phân lớp xerisin đã làm dính bết các sợi tơ và làm bong, tách rời các sợi tơ…
Trong nông nghiệp
Protease được sử dụng để xử lý các phế liệu giàu protein làm thức ăn cho vật nuôi nhằm tăng khả năng tiêu hóa và hệ số tiêu hóa thức ăn.
Trong y học
Dùng chế phẩm protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh kháng độc để chữa bệnh. Một số protease như trypsin, α- chymotrypsin dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh kém tiêu hóa, bệnh nghẽn mạch, tiêu mủ các ổ viêm. [7], [31], [32], [36]
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
2.1.1. Nguyên liệu
Cua đồng sống có nguồn gốc từ đồng bằng sông Cửu Long
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu
Các chủng vi sinh vật :
B.amyloliquefaciensđược phân lập từ cơm mẻ
L.caseiđược phân lập từ chao
A.niger
Do phòng Công nghệ biến đổi sinh học thuộc Viện Sinh học nhiệt đới TP. Hồ Chí Minh cung cấp.
2.1.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
Do phòng Công nghệ biến đổi sinh học thuộc Viện Sinh học nhiệt đới TP. Hồ Chí Minh cung cấp
2.1.4. Các môi trường dinh dưỡng dùng trong nghiên cứu [22],[33]
MT1: Môi trường nước chiết giá đậu để nuôi cấy và giữ giống A.niger
MT2: Môi trường Czapek- Dox để xác định hoạt tính enzyme chitinase và protease
MT3:Môi trường MRS để nuôi cấy và giữ giống L.casei
MT4:Môi trường nước chiết cà chua để nuôi cấy và giữ giống L.casei
MT5: Môi trường thạch cá- pepton (CP) để nuôi cấy và giữ giống
B.amyloliquefaciens
2.2. Phương pháp
Sơ đồ nghiên cứu
Sơ đồ 2.1. Quy trình bố trí thí nghiệm
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu hình thái, các đặc tính sinh học của các chủng vi sinh vật
2.2.1.1. Phương pháp quan sát hình thái A.niger [21]
Đại thể
Nguyên tắc: nấm mốc khi nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa sẽ tạo khuẩn
lạc khổng lồ với những đặc điểm hình thái đặc trưng
Xác định thành phần nguyên liệu cua đồng (protein, khoáng, chitin)
Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp của các VSV
(B.amyloliquefaciensprotease, L.casei acid tổng, A.niger
chitinase)
Xác định thời gian thủy phân và hàm lượng protein, calci, glucosamine
Đánh giá chất lượng dinh dưỡng (xác định chỉ số Nformol, NNH3, Ntổng số, hàm
lượng protein, glucosamine) của nguyên liệu thực phẩm tạo thành
Kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm Hàm lượng kim loại nặng (arsen, chì, thủy ngân) Hàm lượng VSV đường ruột (Coliforms, E.coli, S.aureus) Hoàn thiện sản phẩm
Cách tiến hành
Dùng que cấy lấy 1 ít bào tử từ ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm đựng 5 ml nước cất vô trùng, lắc đều tạo dung dịch huyền phù.
Dùng que cấy móc vuông nhúng vào dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm một điểm vào giữa đĩa Petri có chứa MT1 mục 2.1.3.