M Ở ĐẦU
2.2.2.3. Phương pháp nuôi cấy và xác định hoạt độ protease của
B.amyloliquefaciens
Nuôi cấy B.amyloliquefaciens
Nguyên tắc
Vi khuẩn sử dụng chất dinh dưỡng có sẵn trong môi trường để tăng sinh và tổng hợp enzyme ngoại bào lẫn trong môi trường, ta thu được sinh khối vi khuẩn lẫn enzyme thô trong môi trường.
Tiến hành
trong ống giống thạch nghiêng, cho vào bình tam giác dung tích 250 ml chứ 50ml MT6 (mục 2.1.3), nuôi lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
Nhân giống cấp 2: hút 1% MT giống cấp 1 cho vào bình tam giác dung tích 250 ml chứ 50ml MT6 (mục 2.1.3), nuôi lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng. Canh trường nuôi cấy được ly tâm 5000 vòng/ phút trong 15 phút để thu dịch enzyme thô. Xác định hoạt độ protease được tổng hợp bởi B.amyloliquefaciens [18]
Nguyên tắc
Casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phảnứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin.
Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng enzyme.
Tiến hành
Định lượng enzyme protease trong mẫu
Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm với enzyme
Dung dịch hóa chất Ống nghiệm
1(thí nghiệm) 2(đối chứng)
Enzyme mẫu (ml) 1,0 0,0
Casein 1% (ml) 5,0 5,0
Lắc đều, để trong bể ổn nhiệt ủ ở 300
C trong 10 phút
TCA 5% (ml) 5,0 5,0
Lắc đều và giữ ở 300C, để yên 30 phút. Lọc lấy dịch
Lấy dịch lọc đem xác định hàm lượng sản phẩm tạo thành sau quá trình phân giải của protease bằng phản ứng màu
Phản ứng màu: 1ml dịch lọc thêm 2ml Na2CO3 6%, lắc đều, thêm 0.5ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần, để yên trong 20 phút ở 300C đến khi xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thu ở λ = 660nm.
Bảng 2.3. Đường chuẩn tyrosin
Dung dịch hóa chất Ống nghiệm
1 2 3 4 5 6
Tyrosin chuẩn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Dung dịch HCl 0.2N (ml) 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 Dung dịch NaOH 0.5N (ml) 10 10 10 10 10 10
Thuốc thử Folin (ml) 3 3 3 3 3 3
Lắc mạnh, để yên 10 phút đo mật độ quang ở λ = 660nm
Tính hiệu số mật độ quang giữa các ống với ống 1(ống kiểm tra). Dựng đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa ΔOD với nồng độ protein trong các ống.
Tính kết quả
Một đơn vị hoạt độ là lượng enzyme trong một phút ở 300C phân giải được một lượng protein tương đương với một micromole tyrosin
Hoạt độ 1ml dung dịch enzyme được tính bằng công thức X =a×Vt×b
Trong đó
X: số đơn vị hoạt độ trong 1ml dung dịch enzyme (UI) V: thể tích của hỗn hợp phản ứng với TCA (11ml)
a: số μmol tyrosin tương ứng với hiệu số giá trị mật độ quang trong ống thí nghiệm và ống kiểm tra (được xác định qua đường chuẩn tyrosin).
b: độ pha loãng của dung dịch enzyem nếu có t: thời gian phản ứng (30 phút)
2.2.2.4. Khảo sát các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh protease của B.amyloliquefaciens của B.amyloliquefaciens
Nguyên tắc: Dựa vào các đặc tính sinh lý, sinh hóa của B.amyloliquefaciens
để xác định các điều kiện thích hợp cho B.amyloliquefaciens sinh tổng hợp protease có hoạt độ cao nhất.
Cách tiến hành
Nuôi cấy và thu dịch enzyme thô theo mục 2.2.2.3 tại các thời điểm nuôi cấy 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52 giờ. Xác định hoạt độ protease ở các thời điểm trên theo phương pháp ở mục 2.2.2.3
• Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy
Nuôi cấy B.amyloliquefaciens trong thời gian tốt nhất đã xác định ở thí nghiệm trên ở các nhiệt độ MT là 200
C, 250C, 300C, 350C, 400C, 450C. Thu dịch enzyme, xác định hoạt độ protease theo mục 2.2.2.3
• Khảo sát pH môi trường
Nuôi cấy B.amyloliquefaciens trong thời gian và nhiệt độ tốt nhất đã khảo sát, chỉnh MT về các giá trị pH 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0. Thu dịch enzyme, xác định hoạt độ protease theo mục 2.2.2.3