M Ở ĐẦU
2.2.2. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật và xác định hoạt độ enzyme
Nuôi cấy A.niger [17]
Nguyên tắc: nấm mốc sử dụng chất dinh dưỡng có sẵn trong môi trường để
sinh trưởng và tổng hợp enzyme ngoại bào lẫn trong môi trường, ta thu được sinh khối nấm sợi lẫn enzyme thô trong môi trường.
Tiến hành
Cho vào các bình tam giác (dung tích 250ml) 100ml MT1, hấp khử trùng
1210C/30 phút, để nguội. Cho 10 ml nước cất vô trùng vào ống giống thạch nghiêng, cà nhẹ mặt thạch để bào tử nấm tạo dạng huyền phù. Cho 1-2ml dịch huyền phù bào tử vào mỗi bình tam giác. Nuôi lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng. Canh trường nuôi cấy được ly tâm 5000 vòng/ phút trong 15 phút để thu dịch enzyme thô.
Xác định hoạt độ chitinase của A.niger theo phương pháp Elson –
Morgan [18]
Nguyên tắc: hoạt độ chitinase được xác định dựa trên phương pháp định
lượng glucosamine trong quá trình phân giải chitin
Cách tiến hành
Chuẩn bị dịch huyền phù chitin: 5g chitin hòa tan trong 50ml HCl đậm đặc. Khuấy liên tục trong thời gian 3 phút ở 400C. Sau đó chitin tạo huyền phù bằng cách thêm từ từ 500ml nước lạnh (50
C). Dịch huyền phù thu lại bằng cách lọc qua giấy lọc hoặc ly tâm (3500 vòng/phút trong 7 phút). Huyền phù rửa với nước cất nhiều lần đến pH 6,0-6,5; bảo quản lạnh dịch huyền phù.
Dựng đường chuẩn glucosamine
Cân chính xác 0.1g D- glucosamine, cho nước cất vào đủ 500ml. Từ dung dịch này, pha các dung dịch glucosamine chuẩn có nồng độ từ 10 – 70 μg/ml
Nồng độ glucosamine dịch thủy phân được xác định dựa vào đường chuẩn glucosamine.
Bảng 2.1. Đường chuẩn glucosamine Nồng độ glucosamine chuẩn (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 Thể tích dung dịch glucosamine (ml) 0 5 10 15 20 25 30 35 Thể tích nước cất (ml) 100 95 90 85 80 75 70 65 Bố trí thí nghiệm với enzyme
Cho 1ml dịch huyền phù chitin 1%+ 1ml dịch enzyme. Hỗn hợp ủ ở 300
C trong 20 phút. Phản ứng được ngưng bằng cách đun sôi trong 3 phút.
Tính kết quả
Đơn vị hoạt tính của enzyme chitinase được xác định như sau: Một đơn vị hoạt tính (UI) tương ứng với 1μg glucosamine tạo ra trong thời gian thủy phân chitin 1 phút ở nhiệt độ phản ứng (500
C)
Đơn vị hoạt tính chitinase (UI) = 𝐶∗𝑛∗𝑉1𝑉2∗𝑡∗𝑚 Trong đó
C: hàm lượng glucosamine (μg/ml) trong dịch thí nghiệm đã pha loãng n: hệ số pha loãng
V1: thể tích dịch enzyme ban đầu (ml) V2: thể tích dịch enzyme thí nghiệm (ml) T: thời gian phản ứng (phút)
M: khối lượng enzyme sử dụng (g)
2.2.2.2. Khảo sát các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh chitinase của A.niger của A.niger
Nguyên tắc
Dựa vào các đặc tính sinh lý, sinh hóa của A.niger để xác định các điều kiện thích hợp cho A.niger sinh tổng hợp chitinase cao nhất
Tiến hành
• Xác định thời gian thích hợp để chủng A.niger sinh chitinase có hoạt độ cao nhất
Nuôi cấy A.niger và thu dịch chiết enzyme thô theo mục 2.2.2.1 tại các thời điểm nuôi cấy 24 giờ, 32 giờ, 40 giờ, 48 giờ, 56 giờ, 64 giờ, 72 giờ. Xác định hoạt độ enzyme theo mục 2.2.2.1
• Xác định nhiệt độ thích hợp để A.niger sinh chitinase có hoạt độ cao nhất Nuôi cấy A.niger trong thời gian tốt nhất đã xác định ở thí nghiệm trên ở các nhiệt độ môi trường 200C, 250C, 300C, 350C, 400C, 450C. Thu dịch enzyme, xác định hoạt độ enzyme theo mục 2.2.2.1
• Xác định pH thích hợp để A.niger sinh chitinase có hoạt độ cao nhất
Nuôi cấy A.niger trong thời gian và nhiệt độ tốt nhất đã khảo sát, chỉnh MT về các giá trị pH 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0. Thu dịch enzyme và xác định hoạt độ enzyme theo mục 2.2.2.1
• Xác định nồng độ chất cảm ứng thích hợp để A.niger sinh chitinase có hoạt độ cao nhất
Nuôi cấy A.niger theo thời gian, nhiệt độ và pH đã khảo sát tốt nhất, lần lượt bổ sung chất cảm ứng là huyền phù chitin ở các hàm lượng 0,0% 0,25%, 0,50%, 0,75%, 1,00%, 1,25%, 1,50%. Thu dịch enzyme và xác định hoạt độ enzyme theo mục 2.2.2.1
2.2.2.3. Phương pháp nuôi cấy và xác định hoạt độ protease của B.amyloliquefaciens B.amyloliquefaciens
Nuôi cấy B.amyloliquefaciens
Nguyên tắc
Vi khuẩn sử dụng chất dinh dưỡng có sẵn trong môi trường để tăng sinh và tổng hợp enzyme ngoại bào lẫn trong môi trường, ta thu được sinh khối vi khuẩn lẫn enzyme thô trong môi trường.
Tiến hành
trong ống giống thạch nghiêng, cho vào bình tam giác dung tích 250 ml chứ 50ml MT6 (mục 2.1.3), nuôi lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
Nhân giống cấp 2: hút 1% MT giống cấp 1 cho vào bình tam giác dung tích 250 ml chứ 50ml MT6 (mục 2.1.3), nuôi lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng. Canh trường nuôi cấy được ly tâm 5000 vòng/ phút trong 15 phút để thu dịch enzyme thô. Xác định hoạt độ protease được tổng hợp bởi B.amyloliquefaciens [18]
Nguyên tắc
Casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phảnứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin.
Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng enzyme.
Tiến hành
Định lượng enzyme protease trong mẫu
Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm với enzyme
Dung dịch hóa chất Ống nghiệm
1(thí nghiệm) 2(đối chứng)
Enzyme mẫu (ml) 1,0 0,0
Casein 1% (ml) 5,0 5,0
Lắc đều, để trong bể ổn nhiệt ủ ở 300
C trong 10 phút
TCA 5% (ml) 5,0 5,0
Lắc đều và giữ ở 300C, để yên 30 phút. Lọc lấy dịch
Lấy dịch lọc đem xác định hàm lượng sản phẩm tạo thành sau quá trình phân giải của protease bằng phản ứng màu
Phản ứng màu: 1ml dịch lọc thêm 2ml Na2CO3 6%, lắc đều, thêm 0.5ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần, để yên trong 20 phút ở 300C đến khi xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thu ở λ = 660nm.
Bảng 2.3. Đường chuẩn tyrosin
Dung dịch hóa chất Ống nghiệm
1 2 3 4 5 6
Tyrosin chuẩn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Dung dịch HCl 0.2N (ml) 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 Dung dịch NaOH 0.5N (ml) 10 10 10 10 10 10
Thuốc thử Folin (ml) 3 3 3 3 3 3
Lắc mạnh, để yên 10 phút đo mật độ quang ở λ = 660nm
Tính hiệu số mật độ quang giữa các ống với ống 1(ống kiểm tra). Dựng đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa ΔOD với nồng độ protein trong các ống.
Tính kết quả
Một đơn vị hoạt độ là lượng enzyme trong một phút ở 300C phân giải được một lượng protein tương đương với một micromole tyrosin
Hoạt độ 1ml dung dịch enzyme được tính bằng công thức X =a×Vt×b
Trong đó
X: số đơn vị hoạt độ trong 1ml dung dịch enzyme (UI) V: thể tích của hỗn hợp phản ứng với TCA (11ml)
a: số μmol tyrosin tương ứng với hiệu số giá trị mật độ quang trong ống thí nghiệm và ống kiểm tra (được xác định qua đường chuẩn tyrosin).
b: độ pha loãng của dung dịch enzyem nếu có t: thời gian phản ứng (30 phút)
2.2.2.4. Khảo sát các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh protease của B.amyloliquefaciens của B.amyloliquefaciens
Nguyên tắc: Dựa vào các đặc tính sinh lý, sinh hóa của B.amyloliquefaciens
để xác định các điều kiện thích hợp cho B.amyloliquefaciens sinh tổng hợp protease có hoạt độ cao nhất.
Cách tiến hành
Nuôi cấy và thu dịch enzyme thô theo mục 2.2.2.3 tại các thời điểm nuôi cấy 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52 giờ. Xác định hoạt độ protease ở các thời điểm trên theo phương pháp ở mục 2.2.2.3
• Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy
Nuôi cấy B.amyloliquefaciens trong thời gian tốt nhất đã xác định ở thí nghiệm trên ở các nhiệt độ MT là 200
C, 250C, 300C, 350C, 400C, 450C. Thu dịch enzyme, xác định hoạt độ protease theo mục 2.2.2.3
• Khảo sát pH môi trường
Nuôi cấy B.amyloliquefaciens trong thời gian và nhiệt độ tốt nhất đã khảo sát, chỉnh MT về các giá trị pH 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0. Thu dịch enzyme, xác định hoạt độ protease theo mục 2.2.2.3
2.2.3. Phương pháp khảo sát thành phần môi trường và các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp acid của L.casei đến khả năng tổng hợp acid của L.casei
2.2.3.1. Khảo sát môi trường lên men
Mục đích tận dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền, dễ tìm có khả năng sinh tổng hợp acid. Chúng tôi sử dụng nguyên liệu là dịch tương đậu nành, tiến hành khảo sát các thành phần môi trường bổ sung vào dịch tương như sau:
• Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng đến khả năng tổng hợp
acid của L.casei
Nguyên tắc: Dựa vào đặc tính của VK lactic ưa thích môi trường tự nhiên
giàu dinh dưỡng, vitamin, khoáng chất để sinh trưởng và phát triển.
Tiến hành
Dịch tương đậu nành lọc qua vải lọc
Tất cả môi trường dịch tương đậu nành đều bổ sung thêm 2% đường succrose. Bổ sung thêm một số thành phần khác:
Nước mắm 350N với hàm lượng: 1% (10ml/l môi trường)
Muối khoáng: bổ sung muối khoáng của môi trường MRS với hàm lượng là K2HPO4 2g/l, MgSO4 0,2g/l, MnSO4 0,05 g/l, CH3COONa 5g/l, amonicitrate 2 g/l.
Lấy 1 vòng sinh khối L.casei trong ống giống thạch nghiêng cho vào bình tam giác 250 ml chứa 100 ml MT3 đã hấp vô trùng, nuôi VK trong điều kiện tĩnh, nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Sau 24 giờ nuôi cấy, hút 5% thể tích MT3 đã lên men bởi
L.casei cho vào 200ml dịch môi trường nuôi cấy cần khảo sát, trong điều kiện tĩnh,
ở nhiệt độ phòng. Thời gian lên men là 72 giờ. Xác định lượng acid tổng tạo ra bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1N mục 2.2.1.2
Thay đổi thành phần môi trường theo bảng sau:
Bảng 2.4. Thành phần các chất bổ sung vào môi trường
Môi trường Muối khoáng 1% nước mắm 350N
40% nước chiết giá
MRS làm đối chứng - - -
Dịch tương đậu nành+ 2%succrose - - -
Dịch tương đậu nành+ 2%succrose+ khoáng + - - Dịch tương đậu nành+ 2%succrose+ 40%
nước chiết giá - - +
Dịch tương đậu nành+ 2%succrose+ 1% nước mắm 350
N - + -
Dịch tương đậu nành+ 2%succrose+ 1%
nước mắm 350N+ 40% nước chiết giá - + +
Dịch tương đậu nành+ 2%succrose+
khoáng+ 40% nước chiết giá + - +
Dịch tương đậu nành+ 2%succrose+ khoáng+ 1% nước mắm 350
N + + -
Dịch tương đậu nành+ 2%succrose+ khoáng+ 1% nước mắm 350N+ 40% nước
chiết giá
+ + +
(+): có bổ sung (-): không bổ sung
• Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường
Dựa vào MT phù hợp đã khảo sát, bổ sung các hàm lượng đường từ 0, 2, 4, 6, 8, 10% (w/v) vào 200ml môi trường nuôi cấy. Chọn hàm lượng đường thích hợp để
pháp chuẩn độ với NaOH 0,1N (mục 2.2.1.2)
2.2.3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp acid của L.casei L.casei
• Thời gian nuôi cấy
Dựa vào thành phần MT và hàm lượng đường bổ sung thích hợp ở các thí nghiệm trên, thu dịch tương đậu nành lên men bởi L.casei tại các thời điểm 0, 8, 16, 24, 32, 48, 56, 64, 72, 88, 96 giờ. Chọn thời gian mà L.casei tổng hợp lượng acid cao nhất. Xác định lượng acid tổng bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1N
• Nhiệt độ môi trường nuôi cấy
Thu dịch tương đậu nành lên men bởi L.casei trong thời gian tốt nhất đã xác định ở thí nghiệm trên ở các nhiệt độ MT là 200
C, 250C, 300C, 350C, 400C, 450C. Xác định lượng acid tổng bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1N
• pH môi trường nuôi cấy ban đầu
Dựa vào thời gian và nhiệt độ tốt nhất ở thí nghiệm trên, chỉnh pH môi trường ban đầu tại các giá trị pH= 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. Xác định giá trị pH thích hợp để
L.casei tổng hợp lượng acid cao nhất. Xác định lượng acid tổng bằng phương pháp
chuẩn độ với NaOH 0,1N
• Tỉ lệ giống L.casei ban đầu cho vào môi trường nuôi cấy
Dựa vào thời gian và nhiệt độ, pH tốt nhất đã khảo sát ở thí nghiệm trên. Cho vào môi trường các tỉ lệ giống L.casei từ 1%, 3%, 5%, 7%,10%. Chọn tỉ lệ giống thích hợp tổng hợp lượng acid cao nhất. Xác định lượng acid tổng bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1N
2.2.4. Phân tích các chỉ tiêu của nguyên liệu và sản phẩm 2.2.4.1. Xác định độ ẩm [18] 2.2.4.1. Xác định độ ẩm [18]
Nguyên tắc: làm bay hơi hết hơi nước trong thực phẩm. Cân thực phẩm trước
và sau khi sấykhô, từ đó tính ra % nước có trong thực phẩm.
Tiến hành
Cân đĩa đã được sấy khô, cân 10g mẫu đã chuẩn bị sẵn, nghiền nhỏ cho vào đĩa Petri.
Cho tất cả vào tủ sấy 100–105oC, sấy khô đến trọng lượng không đổi, thường khoảng 6 giờ.
Sấy xong, làm nguội ở bình hút ẩm (25 – 30 phút), đem cân ở cân phân tích.
Tính kết quả
Độ ẩm % X được xác định theo công thức X=(𝐺1−𝐺2)×100
(𝐺1−𝐺2)
Trong đó: G-trọng lượng đĩa Petri (g)
G1: trọng lượng đĩa Petri và trọng lượng mẫu thử trước khi sấy (g) G2: trọng lượng đĩa Petri và trọng lượng mẫu thử sau khi sấy (g)
2.2.4.2. Xác định hàm lượng Nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl [8], [18]
Nguyên tắc: chất đạm khi đem vô cơ hóa sẽ chuyển thành dạng (NH4)2SO4.
Dùng kiềm đặc NaOH đẩy amoniac ra khỏi (NH4)2SO4
(NH4)2SO4+ 2NaOH → 2NH4OH + Na2SO4
Lượng amoniac phóng thích ra được hơi nước lôi cuốn bằng 1 dụng cụ là máy Parnas- Wargner và được dẫn đến 1 bình tam giác có chứa 1 lượng thừa H2SO4
Chuẩn độ lượng H2SO4 còn thừa trong bình hứng bằng NaOH. Từ đây cho phép xác định được lượng amoniac phóng thích ra, có nghĩa là xác định được hàm lượng đạm trong mẫu nguyên liệu.
Cách tiến hành: vô cơ hóa: cân 0,1g mẫu nghiền nhỏ, 1g chất xúc tác vào ống
phá mẫu và thêm 5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc. Nối bộ thu khí, bắt đầu phá mẫu cho đến khi dung dịch trong bình trong suốt hoặc trong xanh (khoảng 2-3giờ), ngừng đun để nguội. Bổ sung 50ml nước cất, lắc đều.
Chưng cất
Lắp ống phá mẫu vào máy chưng cất, bổ sung 10ml NaOH đậm đặc. Khởi động quá trình chưng cất, dịch chưng cất sẽ được chuyển sang bình tam giác 250ml có chứa sẵn 10ml dung dịch H2SO4 0,01N, thêm 5 giọt metyl đỏ.
Ngưng chưng cất khi dịch chưng cất không còn NH3 (thử bằng giấy đo pH). Chuẩn độ lượng thừa H2SO4 bằng NaOH 0,01N. Ngưng chuẩn độ khi dung dịch chuyển từ đỏ sang vàng nhạt
Tính kết quả
Gọi V0 là trị số trung bình của 2 lần thử không (thay mẫu bằng nước cất) Vt là trị số trung bình của 3 lần thử thật
ΔV= V0-Vt là lượng NaOH tương ứng với NH3 phóng thích bởi 10ml dung dịch đạm đã được vô cơ hóa và pha loãng
Nếu nguyên liệu là chất rắn:
%N (hay của N/100g mẫu) = (14 x ΔV x X x10-4 x100)/m Nếu nguyên liệu là chất lỏng:
gN/l = (14 x ΔV x X x 10-4 x 1000)/Vmẫu Trong đó: m- trọng lượng mẫu đem vô cơ hóa (g)
Vmẫu- thể tích mẫu đem vô cơ hóa
2.2.4.3. Xác định hàm lượng Nitơ formol (Nformol) theo phương pháp Sorensen [8]
Nguyên tắc: khi cho các phân tử phi protein tác dụng với formol, sẽ tác dụng
lên nhóm –NH2 để tạo thành phức chất metylen (-N=NH2).
Do vậy, sản phẩm là hợp chất metylen và 1 nhóm chức –COOH tự do hoặc HCl có tính acid, có thể định lượng bằng NaOH với phenolphtalein làm chỉ thị màu, từ lượng NaOH chuẩn độ cho phép xác định 1 cách gián tiếp được lượng Nformol
Cách tiến hành
Trung hòa formol ½ : lấy 50ml formol ½ thêm vào vài giọt phenolphatalein 3%, cho NaOH 0.1N từng giọt tới khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt, ta được formol trung hòa ½
Hút 10ml dung dịch nguyên liệu đã pha loãng 20 lần, thêm vào 10ml dung dịch formol ½ đã trung hòa và vài giọt phenolphatalein 3%, lắc đều để phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau đó định lượng bẳng NaOH 0,1N cho đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng.
Thực hiện 3 lần thử thật và 3 lần thử không
Tính kết quả
Số g Nformol có trong 1 lít nguyên liệu
Trong đó