M Ở ĐẦU
1.4.3.3. Khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của B.amyloliquefaciens
Giới thiệu enzyme protease
Protease là các enzym xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (CO-NH) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự.
-CH - C - N -CH - R O H R’ + H2O - CH - C - OH R O + HN - CH - H R’
Nhiều protease có khả năng liên kết este và vận chuyển acid amin.
Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử quốc tế (1984) đã đề nghị sử dụng thuật ngữ peptidase để chỉ các enzym thủy phân mối liên kết peptide (thuộc phân nhóm E.C 3.4) [69]
Nguồn thu nhận protease
Người ta có thể thu nhận protease từ nhiều nguồn khác nhau: động vật, thực vật và vi sinh vật. Vi sinh vật chính là đối tượng có thể sản xuất enzym nói chung và protease nói riêng với số lượng nhiều và giá thành rẻ.
Protease vi sinh vật có thể được thu nhận từ Bacillus subtilis, B.mesentericus,
B.thermorpoteoliticus. Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích
hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu. Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzym được sử dụng. [52], [56]
Protease thu nhận từ nấm mốc: Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng:
A.oryzae, A.terricola, A.fumigates,…các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả
ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Các protease của nấm hoạt động trong vùng pH khá rộng (pH = 4-11) và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất cao.
Protease thu nhận từ xạ khuẩn: người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S.fradiae, S.erythreus,... [23]. Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được tách chiết từ S.grieus, enzym này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid. [56]
1.4.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng-phát triển và tổng hợp protease của B.amyloliquefaciens hợp protease của B.amyloliquefaciens
Nguồn carbon
Nguồn carbon tự nhiên thường dùng trong môi trường nuôi cấy là bột mì, bột đậu tương, cám và nước chiết của chúng. Nồng độ glucid thích hợp tùy thuộc vào bản chất hóa học của chúng và đặc tính sinh lý của VSV. Nồng độ glucid thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp protease cũng thay đổi theo từng loài VSV. Theo
Ostroko và cs (1977), glucose, saccharose, maltose và sorbitol là nguồn carbon tốt nhất cho sự tổng hợp protease ở B.subtilis [36]
Nguồn nitrogen
Nguồn nitơ trong môi trường nuôi cấy VSV có thể là các chất hữu cơ (protein và các sản phẩm thủy phân của protein) hay các muối vô cơ chứa nitơ (amoni, nitrat). Giá trị dinh dưỡng của các nguồn nitơ khác nhau tùy thuộc vào khả năng thu nhận nitơ từ nguồn là NH3. Nguồn nitơ hữu cơ thường ảnh hưởng tốt đến quá trình tổng hợp protease. Vì vậy chúng có vai trò như chất cảm ứng trong quá trình này. Nguồn nitơ hữu cơ thường dùng: pepton, casein, albumin, bột đậu tương,... Nguồn nitơ vô cơ: (NH4)2SO4, các muối clorua, sulphate, nitrate amon. Phối hợp nguồn nitơ hữu cơ và nitơ vô cơ làm tăng đáng kể quá trình tổng hợp protease.
Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzyme của VSV cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp. Tùy từng chủng VSV mà nhiệt độ thích hợp khác nhau: nấm mốc thường phát triển ở nhiệt độ 22-320C, còn VK thì phát triển ở nhiệt độ cao hơn thường là 35-550C. Đa số VSV tổng hợp enzyme không bền với nhiệt độ và bị kìm hãm nhanh chóng khi ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp. [55]
pH môi trường
pH môi trường thường ít bị tác động khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt. Khi dùng phương pháp nuôi cấy bề sâu ( nuôi cấy chìm), pH có ảnh hưởng rất lớn đến sự tích lũy protease trong môi trường. pH của môi trường thay đổi sau khi thanh trùng MT và đặc biệt thay đổi rất lớn trong quá trình nuôi cấy. Trong quá trình nuôi cấy, tùy theo thành phần MT và các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật mà pH của môi trường sẽ chuyển dần về phía acid hay kiềm. Các loài thuộc
giống Bacillus đa số tổng hợp nên protease trung tính và kiềm tính.
B.amyloliquefaciens tổng hợp nên protease trung tính, pH môi trường phù hợp trong