Phương pháp quan sát hình thái A.niger

M Ở ĐẦU

2.2.1.1.Phương pháp quan sát hình thái A.niger

 Đại thể

 Nguyên tắc: nấm mốc khi nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa sẽ tạo khuẩn

lạc khổng lồ với những đặc điểm hình thái đặc trưng

Xác định thành phần nguyên liệu cua đồng (protein, khoáng, chitin)

Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp của các VSV

(B.amyloliquefaciensprotease, L.casei  acid tổng, A.niger 

chitinase)

Xác định thời gian thủy phân và hàm lượng protein, calci, glucosamine

Đánh giá chất lượng dinh dưỡng (xác định chỉ số Nformol, NNH3, Ntổng số, hàm

lượng protein, glucosamine) của nguyên liệu thực phẩm tạo thành

Kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm Hàm lượng kim loại nặng (arsen, chì, thủy ngân) Hàm lượng VSV đường ruột (Coliforms, E.coli, S.aureus) Hoàn thiện sản phẩm

 Cách tiến hành

Dùng que cấy lấy 1 ít bào tử từ ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm đựng 5 ml nước cất vô trùng, lắc đều tạo dung dịch huyền phù.

Dùng que cấy móc vuông nhúng vào dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm một điểm vào giữa đĩa Petri có chứa MT1 mục 2.1.3.

Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 5-7 ngày để tạo khuẩn lạc khổng lồ, hàng ngày lấy ra quan sát và mô tả các điểm sau:

- Tốc độ phát triển của khuẩn lạc (đo đường kính khuẩn lạc)

- Hình dạng, kích thước và mép khuẩn lạc.

- Màu sắc và sự biến đổi màu sắc của khuẩn lạc

- Giọt tiết, sắc tố tiết vào MT.  Vi thể (làm tiêu bản phòng ẩm) [21]

 Nguyên tắc

Cấu trúc hiển vi hệ sợi nấm và bào tử của A.niger ở trạng thái tự nhiên được quan sát dễ dàng dưới kính hiển vi

 Cách tiến hành

Đặt vào đáy đĩa Petri một tờ giấy thấm và một tấm lame, bao gói, hấp tiệt trùng. Đổ MT1 lỏng vào tấm lame sao cho thạch chảy dài một nửa bên của tấm lame. Dùng que cấy móc cấy ria khuẩn lạc A.niger lên phần thạch trên tấm lame

Gói cả hộp lại và nuôi ủ ở nhiệt độ thường từ 12 giờ – 24 giờ. Mở đĩa Petri và lấy lame bên trong ra. Dùng giấy thấm chùi mặt đáy miếng lame.

Đẩy lame lên chỗ có khuẩn lạc mọc và đặt dưới kính hiển vi để quan sát mẫu ở trạng thái sống với vật kính có độ phóng đại 10X và 60X.

Quan sát các đặc điểm:

- Khuẩn ty: hình dáng, màu sắc, vách ngăn, sự phân nhánh.

- Đặc điểm cơ quan sinh bào tử: cuống sinh bào tử, thể bình và bào tử.  Đặc tính sinh học của A.niger [33]

 Nguyên tắc: thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu sắc đặc trưng, còn phần cơ chất bị enzyme ngoại bào của A.niger phân hủy sẽ có màu trong suốt quanh khuẩn lạc

 Tiến hành

A. niger nuôi trên MT1 dịch thể bổ sung 1% huyền phù chitin. Nuôi cấy lắc ở (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

nhiệt độ phòng, sau 24 giờ, lọc lấy dịch enzyme thô

Dùng khoan nút chai (vô trùng) khoan các lỗ thạch trên MT2 mục 2.1.3 bổ sung 1% huyền phù chitin. Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml dịch chiết enzyme thô vào lỗ khoan. Giữ các hộp Petri trong tủ lạnh (40C trong 4-6 giờ). Sau đó chuyển sang tủ ấm (280- 300) trong 24giờ. Sau 24giờ, dùng thuốc thử Lugol nhỏ lên bề mặt thạch, quan sát kết quả, đo đường kính vòng phân giải bằng thước đo khuẩn lạc.

Xác định khả năng sinh enzyme của A.niger bằng thuốc thử rồi đo kích thước vòng phân giải (D – d) mm.

Trong đó: D: đường kính vòng phân giải, d: đường kính khuẩn lạc

- (D – d) ≥ 25mm : hoạt tính rất mạnh

- (D – d) ≥ 20mm : mạnh

- (D – d) ≥ 10-19,5 mm : trung bình

- (D – d) ≤ 10mm : yếu

2.2.1.2. Phương pháp quan sát hình thái, đặc tính sinh học của L.casei và B.amyloliquefaciens

 Đại thể [22]

 Nguyên tắc

VK có thể tạo khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường thạch đĩa với hình thái đặc trưng.

 Tiến hành

Dùng que cấy móc tròn lấy 1 ít sinh khối VK được nuôi trong ống giống thạch nghiêng từ 24- 48 giờ, ở nhiệt độ phòng. Sau đó, cấy ria vào đĩa Petri chứa MT3 đối với VK L.casei và MT5 mục 2.1.3 đối với B amyloliquefaciens

Quan sát, mô tả hình dạng đặc trưng, màu sắc, trạng thái, kích thước khuẩn lạc.  Vi thể (nhuộm Gram) [33]

 Nguyên tắc

Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh (crystal violet) và iod mà hình thành nên 2 loại phức chất khác nhau.

Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn. VSV có phức chất này thuộc loại Gram dương.

Loại phức chất thứ hai không giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lí bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. VSV có phức chất này thuộc loại Gram âm.

 Tiến hành

Làm tiêu bản:

Dùng que cấy lấy nước cất vô trùng để làm vết bôi trên phiến kính

Dùng que cấy lấy một chút khuẩn lạc của VK được nuôi trong ống giống thạch nghiêng từ 16- 24 giờ, làm vết bôi. Để khô vết bôi trong không khí hoặc cố định nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn.

Nhuộm tiêu bản:

Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi

Nhuộm tiêu bản bằng thuốc tím kết tinh qua giấy lọc trong 1 phút Nhuộm lugol trong 1 phút

Rửa nước, tẩy bằng cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản nhỏ từ từ từng giọt cồn chon đến khi tan hết màu

Rửa nước, nhuộm bổ sung Fuchsin hay safranin từ 10-30 giây Rửa nước, làm khô và soi tiêu bản với vật kính dầu

 Đặc tính sinh học của vi khuẩn L.casei

Định tính acid lactic [21] (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

 Nguyên tắc

Khi tác dụng với acid lactic, thuốc thử Ufermen sẽ đổi màu từ xanh tím sang màu vàng. Quan sát sự đổi màu của thuốc thử ta có thể xác định được khả năng tạo

acid của VK

 Tiến hành

Dùng que móc vòng, lấy 1 vòng sinh khối L.casei cho vào 5ml MT3 lỏng đã hấp vô trùng. Lên men tĩnh ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Sau đó cho dịch lên men phản ứng với thuốc thử Ufermen. Chuẩn bị các ống nghiệm chứa thành phần như sau

Ống 1: 3ml dịch môi trường, 1ml thuốc thử Ufermen. Ống 2: 3ml dịch lên men, 1ml thuốc thử Ufermen. Ống 3: 3ml acid lactic 98%, 1ml thuốc thử Ufermen. Quan sát và nhận xét sự đổi màu của thuốc thử.

Định lượng acid tổng [21]

Nguyên tắc

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic và các sản phẩm khác.

Tiến hành

Cho vào bình tam giác 100ml: 10ml dịch lên men VK thêm vào 30ml nước cất và 1-2 giọt phenolphtalein 0,1%. Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền vững. Thực hiện mẫu đối chứng là dịch chưa lên men.

Hàm lượng acid tổng (∑a g/l) được tính theo công thức sau: ∑𝑎 (𝑔/𝑙) = (𝑉 − 𝑉𝑜) × 0,1 ×9010 = (𝑉 − 𝑉𝑜) × 0,9

Trong đó: V – số ml dung dịch NaOH dùng trung hòa 10ml dịch lên men

Vo – số ml dung dịch NaOH dùng trung hòa 10ml dịch đối chứng (dịch chưa lên men).

 Đặc tính sinh học của B.amyloliquefaciens

Khả năng sinh protease ngoại bào bằng cách tạo vòng phân giải casein

 Nguyên tắc: vòng phân giải casein được tạo bởi vi sinh vật tiết protease phân

giải casein thành polypeptide và acid amin.

trong ống giống thạch nghiêng, chuyển vào bình tam giác 250 ml chứa 50 ml MT6 đã hấp vô trùng. Nuôi trên máy lắc 150 vòng/phút, trong 24 giờ, ở nhiệt độ phòng. Ly tâm dịch nuôi cấy 5000 vòng/phút trong 15 phút, được dịch enzyme thô. Đục một lỗ trên MT2 thạch đĩa có bổ sung 1% casein. Nhỏ 0,2 ml dịch enzyme thô vào trong lỗ thạch, ủ ở 370

C trong 24 giờ.

Xác định khả năng sinh protease bằng đường kính vòng phân giải casein (D-d) mm

2.2.1.3. Xác định sinh khối tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc [33]

 Nguyên tắc:

Cấy 1 thể tích xác định huyền phù cần nghiên cứu lên môi trường đặc trưng trong đĩa Petri.

Xác định số lượng tế bào bằng cách đếm số khuẩn lạc mọc lên sau thời gian nuôi cấy vì mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát triển của một tế bào.

 Tiến hành

Pha mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp. Pha loãng mẫu cần xác định bằng dung dịch nước muối sinh lý. Dùng pipetman hút 0,1ml dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa thạch. Dùng que gạt vô trùng dàn thật đều trên khắp mặt thạch để tách riêng rẽ từng tế bào. Mỗi mẫu cấy 3 nồng độ liên tiếp, mỗi nồng độ cấy 3 đĩa Petri và lấy kết quả trung bình

Đặt các đĩa thạch vào tủ ấm ở nhiệt độ 37oC trong 48 giờ. Kết thúc thời gian ủ, lấy đĩa thạch ra và đếm số khuẩn lạc hình thành trong 1ml mẫu. Công thứ tính:

M ( CFU/g hay CFU/ml) = Ai x Di/V Trong đó:

A : số khuẩn lạc hình thành trong 1đĩa Di: độ pha loãng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

2.2.2. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật và xác định hoạt độ enzyme 2.2.2.1. Nuôi cấy và xác định hoạt độ chitinase của A.niger 2.2.2.1. Nuôi cấy và xác định hoạt độ chitinase của A.niger

 Nuôi cấy A.niger [17]

 Nguyên tắc: nấm mốc sử dụng chất dinh dưỡng có sẵn trong môi trường để

sinh trưởng và tổng hợp enzyme ngoại bào lẫn trong môi trường, ta thu được sinh khối nấm sợi lẫn enzyme thô trong môi trường.

 Tiến hành

Cho vào các bình tam giác (dung tích 250ml) 100ml MT1, hấp khử trùng

1210C/30 phút, để nguội. Cho 10 ml nước cất vô trùng vào ống giống thạch nghiêng, cà nhẹ mặt thạch để bào tử nấm tạo dạng huyền phù. Cho 1-2ml dịch huyền phù bào tử vào mỗi bình tam giác. Nuôi lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng. Canh trường nuôi cấy được ly tâm 5000 vòng/ phút trong 15 phút để thu dịch enzyme thô.

 Xác định hoạt độ chitinase của A.niger theo phương pháp Elson –

Morgan [18]

 Nguyên tắc: hoạt độ chitinase được xác định dựa trên phương pháp định

lượng glucosamine trong quá trình phân giải chitin

 Cách tiến hành

Chuẩn bị dịch huyền phù chitin: 5g chitin hòa tan trong 50ml HCl đậm đặc. Khuấy liên tục trong thời gian 3 phút ở 400C. Sau đó chitin tạo huyền phù bằng cách thêm từ từ 500ml nước lạnh (50

C). Dịch huyền phù thu lại bằng cách lọc qua giấy lọc hoặc ly tâm (3500 vòng/phút trong 7 phút). Huyền phù rửa với nước cất nhiều lần đến pH 6,0-6,5; bảo quản lạnh dịch huyền phù.

Dựng đường chuẩn glucosamine

Cân chính xác 0.1g D- glucosamine, cho nước cất vào đủ 500ml. Từ dung dịch này, pha các dung dịch glucosamine chuẩn có nồng độ từ 10 – 70 μg/ml

Nồng độ glucosamine dịch thủy phân được xác định dựa vào đường chuẩn glucosamine.

Bảng 2.1. Đường chuẩn glucosamine Nồng độ glucosamine chuẩn (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 Thể tích dung dịch glucosamine (ml) 0 5 10 15 20 25 30 35 Thể tích nước cất (ml) 100 95 90 85 80 75 70 65 Bố trí thí nghiệm với enzyme

Cho 1ml dịch huyền phù chitin 1%+ 1ml dịch enzyme. Hỗn hợp ủ ở 300

C trong 20 phút. Phản ứng được ngưng bằng cách đun sôi trong 3 phút.

 Tính kết quả

Đơn vị hoạt tính của enzyme chitinase được xác định như sau: Một đơn vị hoạt tính (UI) tương ứng với 1μg glucosamine tạo ra trong thời gian thủy phân chitin 1 phút ở nhiệt độ phản ứng (500

C)

Đơn vị hoạt tính chitinase (UI) = 𝐶∗𝑛∗𝑉1𝑉2∗𝑡∗𝑚 Trong đó

C: hàm lượng glucosamine (μg/ml) trong dịch thí nghiệm đã pha loãng n: hệ số pha loãng

V1: thể tích dịch enzyme ban đầu (ml) V2: thể tích dịch enzyme thí nghiệm (ml) T: thời gian phản ứng (phút)

M: khối lượng enzyme sử dụng (g)

2.2.2.2. Khảo sát các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh chitinase của A.niger của A.niger

 Nguyên tắc

Dựa vào các đặc tính sinh lý, sinh hóa của A.niger để xác định các điều kiện thích hợp cho A.niger sinh tổng hợp chitinase cao nhất (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

 Tiến hành

• Xác định thời gian thích hợp để chủng A.niger sinh chitinase có hoạt độ cao nhất

Nuôi cấy A.niger và thu dịch chiết enzyme thô theo mục 2.2.2.1 tại các thời điểm nuôi cấy 24 giờ, 32 giờ, 40 giờ, 48 giờ, 56 giờ, 64 giờ, 72 giờ. Xác định hoạt độ enzyme theo mục 2.2.2.1

• Xác định nhiệt độ thích hợp để A.niger sinh chitinase có hoạt độ cao nhất Nuôi cấy A.niger trong thời gian tốt nhất đã xác định ở thí nghiệm trên ở các nhiệt độ môi trường 200C, 250C, 300C, 350C, 400C, 450C. Thu dịch enzyme, xác định hoạt độ enzyme theo mục 2.2.2.1

• Xác định pH thích hợp để A.niger sinh chitinase có hoạt độ cao nhất

Nuôi cấy A.niger trong thời gian và nhiệt độ tốt nhất đã khảo sát, chỉnh MT về các giá trị pH 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0. Thu dịch enzyme và xác định hoạt độ enzyme theo mục 2.2.2.1

• Xác định nồng độ chất cảm ứng thích hợp để A.niger sinh chitinase có hoạt độ cao nhất

Nuôi cấy A.niger theo thời gian, nhiệt độ và pH đã khảo sát tốt nhất, lần lượt bổ sung chất cảm ứng là huyền phù chitin ở các hàm lượng 0,0% 0,25%, 0,50%, 0,75%, 1,00%, 1,25%, 1,50%. Thu dịch enzyme và xác định hoạt độ enzyme theo mục 2.2.2.1

2.2.2.3. Phương pháp nuôi cấy và xác định hoạt độ protease của B.amyloliquefaciens B.amyloliquefaciens

 Nuôi cấy B.amyloliquefaciens

 Nguyên tắc

Vi khuẩn sử dụng chất dinh dưỡng có sẵn trong môi trường để tăng sinh và tổng hợp enzyme ngoại bào lẫn trong môi trường, ta thu được sinh khối vi khuẩn lẫn enzyme thô trong môi trường.

 Tiến hành

trong ống giống thạch nghiêng, cho vào bình tam giác dung tích 250 ml chứ 50ml MT6 (mục 2.1.3), nuôi lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.

Nhân giống cấp 2: hút 1% MT giống cấp 1 cho vào bình tam giác dung tích 250 ml chứ 50ml MT6 (mục 2.1.3), nuôi lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng. Canh trường nuôi cấy được ly tâm 5000 vòng/ phút trong 15 phút để thu dịch enzyme thô.  Xác định hoạt độ protease được tổng hợp bởi B.amyloliquefaciens [18]

 Nguyên tắc

Casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phảnứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin.

Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng enzyme.

 Tiến hành

Định lượng enzyme protease trong mẫu

Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm với enzyme

Dung dịch hóa chất Ống nghiệm

1(thí nghiệm) 2(đối chứng)

Enzyme mẫu (ml) 1,0 0,0

Casein 1% (ml) 5,0 5,0

Lắc đều, để trong bể ổn nhiệt ủ ở 300

C trong 10 phút

TCA 5% (ml) 5,0 5,0

Lắc đều và giữ ở 300C, để yên 30 phút. Lọc lấy dịch

Lấy dịch lọc đem xác định hàm lượng sản phẩm tạo thành sau quá trình phân giải của protease bằng phản ứng màu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Phản ứng màu: 1ml dịch lọc thêm 2ml Na2CO3 6%, lắc đều, thêm 0.5ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần, để yên trong 20 phút ở 300C đến khi xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thu ở λ = 660nm.

Bảng 2.3. Đường chuẩn tyrosin

Dung dịch hóa chất Ống nghiệm

1 2 3 4 5 6

Tyrosin chuẩn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Dung dịch HCl 0.2N (ml) 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 Dung dịch NaOH 0.5N (ml) 10 10 10 10 10 10

Thuốc thử Folin (ml) 3 3 3 3 3 3

Lắc mạnh, để yên 10 phút đo mật độ quang ở λ = 660nm

Tính hiệu số mật độ quang giữa các ống với ống 1(ống kiểm tra). Dựng đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa ΔOD với nồng độ protein trong các ống.

 Tính kết quả

Một đơn vị hoạt độ là lượng enzyme trong một phút ở 300C phân giải được một lượng protein tương đương với một micromole tyrosin

Hoạt độ 1ml dung dịch enzyme được tính bằng công thức X =a×Vt×b

Trong đó

X: số đơn vị hoạt độ trong 1ml dung dịch enzyme (UI) V: thể tích của hỗn hợp phản ứng với TCA (11ml)

a: số μmol tyrosin tương ứng với hiệu số giá trị mật độ quang trong ống thí nghiệm và ống kiểm tra (được xác định qua đường chuẩn tyrosin).

b: độ pha loãng của dung dịch enzyem nếu có t: thời gian phản ứng (30 phút)

2.2.2.4. Khảo sát các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh protease của B.amyloliquefaciens của B.amyloliquefaciens

 Nguyên tắc: Dựa vào các đặc tính sinh lý, sinh hóa của B.amyloliquefaciens

để xác định các điều kiện thích hợp cho B.amyloliquefaciens sinh tổng hợp protease