M Ở ĐẦU
1.4.1. Nấm mốc Aspergillus niger
Ngành: Ascomycota Lớp: Deuteromyces Bộ: Moniliales Họ: Moniliaceace Giống: Aspergillus
Loài: Aspergillus niger [12]
Van Tieghem là người đầu tiên phát hiện và phân lập chủng nấm mốc A.niger
từ hạt chứa nhiều dầu như hạt đậu phộng, đậu tương, ngũ cốc, A.niger cũng được phân lập từ các sản phẩm lên men truyền thống.
Giống Aspergillus do Michelli mô tả lần đầu tiên vào năm 1729. Năm 1901, Wehmer đã cho ra đời một chuyên luận phân loại giống nấm bất toàn này. [12]
1.4.1.2. Đặc điểm sinh học
cuống sinh thể bình phình ra rõ rệt ở đầu tạo thành bọng lớn hình cầu 20-30µm, màu nâu đen.
Thể bình gồm 2 lớp, lớp thứ nhất hình tam giác cân ngược, lớp thứ hai hình chai, bào tử đính xòe ra, có hình cầu xù xì, có gai, màu nâu đến đen than, đường kính 4-5µm. [11], [12]
1.4.1.3. Khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của A.niger
Giới thiệu về chitinase
Chitinase còn gọi là [poly β-1,4-(2- acetamido-2-deoxy)-D-glucosid
glucanohydrolase. Là enzyme thuỷ phân chitin thành các đơn phân N- acetylglucosamine, chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thuỷ giải liên kết β-1,4-glucoside giữa C1 và C4 của 2 phân tử N-acetylglucosamine liên tiếp nhau trong chitin. Chitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin, sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân tử khác nhau. Việc sử dụng enzyme thô trở thành thay thế trong việc tạo ra các oligomer có nguồn gốc chitin. [51]
Nguồn thu nhận chitinase
Chitinase được tìm thấy trong vi khuẩn: Chromobacterium, Klebsiella,
Pseudomonas, Clostridium, Vibrio và đặc biệt là ở nhóm Streptomycetes.
Chitinase cũng được tạo ra bởi các loài nấm sợi. Các chủng nấm mốc cho enzyme chitinase cao như: Trichoderma, Aspergillus, Gliocladium, Calvatia,…đặc biệt là ở các loài nấm lớn như Lycoperdon, Coprinus
Chitinase còn có từ một số động vật nguyên sinh và từ các mô, tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật không xương: ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân đốt.
Đối với động vật có xương sống, chitinase được tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của những loài chim, thú ăn sâu bọ. Chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài (cuticle) trong quá trình biến thái hay lột xác.
Các thực vật bậc cao có khả năng tạo enzyme chitinase như: cao su (Hevea
số loài tảo biển cũng là nguồn cung cấp enzyme chitinase. [16], [53]
1.4.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng-phát triển và tổng hợp chitinase của A.niger chitinase của A.niger
Nguồn carbon
A.niger có khả năng đồng hóa tốt các loại đường monosaccharide, disaccharide
như glucose, fructose, maltose, sucrose.[17]
Chitin (có thể ở dạng huyền phù, dạng bột hay dạng thô) và các dẫn xuất của chitin vừa là cơ chất cảm ứng, vừa là nguồn carbon làm tăng khả năng sinh chitinase. Nghiên cứu của Jesú de la Cruz và cộng sự (1922) chỉ ra rằng nấm sợi tạo chitinase khi có nguồn carbon là chitin chứ không phải là nguồn cellulose hay nguồn nào khác.
Nguồn nitrogen
Takashi và CS (2002) nghiên cứu khả năng sinh chitinase từ nấm sợi
Aspergillus sp. chỉ ra rằng hoạt tính chitinase cao khi sử dụng nguồn nitrogen từ
(NH4)2SO4. Bổ sung 2% cao nấm men (w/v) vào môi trường nuôi cấy bán rắn thì hoạt tính chitinase của nấm sợi tăng lên đáng kể (Nampoothiri, 2003). [13], [17]
Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của
A.niger. Chúng sinh trưởng được ở nhiệt độ tối thiểu là 6-80
C và tối đa là 45-470 C, tối ưu ở 28-350C. Aspergillus sp. tổng hợp chitinase có hoạt tính cao nhất ở điều kiện nhiệt độ 370
C (Takashi và cs, 2002). [17], [20]
Độ pH
Khoảng pH mà A.niger sinh trưởng tốt là ở môi trường hơi acid pH=4- 6,5. Tuy nhiên, có một số chủng A.niger sinh trưởng được ở pH=2 (Patt, 1981). [13], [68]. Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH môi trường ban đầu thích hợp là acid, trung tính hay kiềm. Aspergillus sp. tổng hợp chitinase cao nhất ở pH môi trường từ 5- 6, Trichoderma harzianumsinh trưởng thích hợp để tổng hợp chitinase ở pH môi trường từ 4- 6.
Chất cảm ứng
Chitinase có thể là enzyme cảm ứng hoặc enzyme cấu trúc. Trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp chitinase, người ta đều bổ sung thêm cơ chất chitin nhằm kích thích khả năng sinh chitinase của vi sinh vật. Nhìn chung, sự hiện diện của chitin trong môi trường nuôi cấy hữu ích cho việc tạo chitinase (Monreal và Reese, 1969). Trong số các cơ chất, chitin huyền phù có khả năng thúc đẩy tạo chitinase cao nhất (Bhushan, 2000). Trong hầu hết các trường hợp, khi nồng độ chitin khoảng 1-1,5% là vi sinh vật có khả năng tạo chitinase (Felse và Panda, 2000). [17]
1.4.1.5. Ứng dụng của A.niger và enzyme chitinase
Ứng dụng của A.niger
Từ lâu, con người đã biết sử dụng A.niger để sản xuất acid hữu cơ. Đặc biệt
A.niger có khả năng tổng hợp acid citric rất mạnh, lượng acid citric sử dụng trên thị
trường hiện nay được sản xuất bằng phương pháp lên men tới 90%.
Ngoài ra, A.nigerđược dùng để sản xuất các chế phẩm enzyme, chế phẩm giàu protein… phục vụ phát triển trong thực phẩm, dược phẩm và chăn nuôi do A.niger
không sinh độc tố aflatoxin. [20], [41]
Ứng dụng của chitinase
Chitinase được ứng dụng nhiều trong nông nghiệp là tác nhân đấu tranh sinh học đối với các sinh vật gây hại (sâu bọ, côn trùng) cụ thể sản xuất các chế phẩm bảo vệ thực vật, thuốc trừ sâu nguồn gốc sinh học. Chitinase từ Bacillus cereus
YQ308 ức chế sự phát triển của nấm bệnh thực vật như Fusarium oxyporum,
Penicillium ultimum (Change & cộng sự, 2003). [17]
Trong y học chitinase thu nhận từ Vibrio alginolyticus đã sử dụng để sản xuất chitopentaose từ cơ chất huyền phù chitin (Murao & cộng sự, 1992). Chitohexaose và chitoheptaose được phát hiện có tính kháng các khối u. [59], [60]
Chitooligosaccharide, glucosamine và N-acetyl glucosamine là nguyên liệu dùng để sản xuất thuốc cho người được tạo ra nhờ chitinase phân cắt mạch chitin…[17]
1.4.2. Vi khuẩn Lactobacillus casei 1.4.2.1. Vị trí phân loại 1.4.2.1. Vị trí phân loại Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ: Lactobacillaceae Giống: Lactobacillus
Loài: Lactobacillus casei [20]
1.4.2.2. Đặc điểm sinh học
Tế bào hình que ngắn, thường có kích thước 0,5 – 1,2 x 1 – 10µm, đôi khi có dạng hình cầu kết thành chuỗi ngắn, hiếm khi di động bằng lông roi. Khuẩn lạc có kích thước 2-5mm, dạng lồi, mờ đục.
Là vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, kị khí không bắt buộc nhưng phát triển tốt hơn trong điều kiện không có oxy hay có bổ sung thêm 5% CO2. Hình thức dinh dưỡng là hóa dưỡng hữu cơ, đòi hỏi môi trường nuôi cấy phải giàu chất dinh dưỡng phức tạp. Chúng không khử được nitrate, không làm tan gelatin, không có catalase cũng như cytochrome. Lên men tạo acid lactic, hiếm khi gây bệnh. [10], [20], [36]
1.4.2.3. Cơ sở hóa sinh của quá trình lên men lactic
Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kị khí đường với sự tích lũy của acid lactic trong môi trường. Có 2 kiểu lên men lactic: lên men đồng hình và lên men dị hình.
Lên men lactic đồng hình: Quá trình lên men tạo sản phẩm chính là acid lactic, lượng acid lactic chiếm 90-98% tổng sản phẩm lên men.
Lên men lactic dị hình: Sản phẩm lên men ngoài acid lactic còn có hàng loạt các sản phẩm khác với tỷ lệ khá cao như acid lactic 40%, ngoài ra còn có các sản phẩm: ethanol, diacetyl, CO2. [14], [20]
Hình 1.8. Sơ đồ chuyển hóa lên men lactic đồng hình và dị hình [71] 1.4.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn L.casei
Nguồn carbon
Nguồn carbon quan trọng cho VK lactic là monosaccharide và disaccharide. Các loại đường cung cấp cho VK lactic sử dụng là: maltose, glucose, galactose, succrose, dextrin, lactose,…[64]
Nguồn nitrogen
Một số các VK lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ. Để đảm bảo cho sự phát triển của vi khuẩn này, chúng phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường.
Nguồn cung cấp nitơ cho VK lactic sử dụng chủ yếu có trong các sản phẩm thủy phân từ thịt, casein, pepton, nấm men thủy phân…[35]
Các muối vô cơ
VK lactic cần nhiều các muối vô cơ cho qua trình hoạt động của mình như Cu2+, Fe2+, K+, Mn2+, Mg2+,… Mn2+ngăn cản quá trình tự phân của tế bào. Đối với Lactobacillus thì Fe2+, Mn2+, Mg2+ có tác động tích cực lên sự phát triển và sinh acid lactic. Ngoài ra, Mg2+ giúp VK sử dụng tốt hơn các loại đường. [35]
Vitamin
Đa số vi khuẩn lactic (đặc biệt là trực khuẩn đồng hình như L.casei) rất kén chọn thành phần dinh dưỡng, chúng chỉ phát triển khi trên môi trường có tương đối đầy đủ các yếu tố dinh dưỡng cần thiết như acid amin, peptide, protein, vitamin nhóm B (B1, B2, B6, PP),…
Ngoài vitamin và acid amin, VK lactic còn có nhu cầu lớn về các hợp chất hữu cơ cho sự phát triển. Đó chính là lý do sử dụng các muối acetat, muối citrate, Tween-80 (một dẫn xuất của acid oleic), trong thành phần môi trường nuôi cấy VK lactic. [35], [64]
Nhiệt độ
Tùy thuộc nhiệt độ tối ưu cho lên men và sinh trưởng, VK lactic chia thành 2 nhóm ưa ấm và ưa nhiệt.
Các loài có nhiệt độ phát triển tối ưu trong khoảng 200
C- 400C được gọi là các loài ưa ấm. Các loài có nhiệt độ phát triển từ 450C- 620C là các loài ưa nhiệt.
Nhiệt độ tối ưu cho L.casei phát triển là 30-350C [20]
Độ pH
Hoạt động của VK lactic, đặc biệt là hệ enzyme của chúng chịu tác động mạnh của pH. Mỗi enzyme đều có vùng pH tối ưu mà tại đó hoạt lực của enzyme là mạnh nhất. Tuy nhiên, pH nội bào của VK lactic lại không tương ứng với pH tối ưu của các enzyme nội bào mà nó chứa. Đa số trực khuẩn lactic có thể phát triển được ở pH = 3,8-4,0. Hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn lactic ở vùng pH = 5,5-6,5. [20], [35]
Chất ức chế
Các chất kháng sinh (peniciline, choloramphenycol,…) có thể ức chế sự sinh trưởng của VK lactic.
Ngoài ra, trong quá trình lên men thì acid lactic được sinh ra, đầu tiên sẽ có tác dụng ức chế các loại vi sinh vật khác. Sau đó, lượng acid tích lũy đủ lớn khoảng 2,2% sẽ ức chế lại VK lactic. Sự acid hóa tế bào chất gây ra sự tích lũy nội bào acid lactic, chính acid lactic là chất ức chế VK lactic
Vì thế acid lactic tạo thành trong quá trình lên men cần được trung hòa liên tục để tối ưu cho sự phát triển nằm trong khoảng pH từ 5,0- 6,5.[10], [35]
1.4.2.5. Các ứng dụng của vi khuẩn lactic và L.casei
Sản xuất acid lactic
Nhu cầu sử dụng acid lactic trên thế giới rất lớn từ 12-15% tổng lượng acid/năm (Akerberg and Zacchi, 2000) và quan trọng đối với ngành công nghiệp thực phẩm (Lượng, 2006), [20], [73]
Vì vậy, việc nghiên cứu tận dụng các loại môi trường rẻ tiền để lên men sản xuất acid lactic rất cần thiết. Một số loại nguyên liệu đã được ứng dụng làm nguyên liệu lên men:
Bảng 1.4. Một số nguyên liệu được dùng để lên men acid lactic [71]
Nguyên liệu Vi sinh vật Acid lactic
(g/l) Nguồn
Rỉ đường L. delbrueckii 107,0 Beunavennature P.
Calabia&cộng sự (2002) Ngũ cốc Enterococcus faecalis RKY1 102,0 Oh & cộng sự (2005) Gỗ L. delbrueckii NRRLB- 445 108,0 Moldes (2001) Cellulose L.coryniformis
ssp.toquen ATTC 2560 24 Miura & cộng sự (2003)
Whey Enterococcus faecalis
RKY1 93 Wee & cộng sự (2004)
Ngoài ra, đã có vài công trình nghiên cứu tận dụng dịch tương đậu nành để làm môi trường lên men lactic.
Dịch tương đậu nành là thành phần nước ép sau quá trình đông tụ sữa trong quy trình sản xuất đậu phụ. Loại nước này thải ra môi trường làm ô nhiễm nguồn nước. Tuy nhiên, dịch tương đậu nành chứa nhiều chất dinh dưỡng còn sót lại của hạt đậu nành. Hackler và cộng sự (1963), đã chỉ ra rằng 16% chất khô và 9% protein đã đi vào dịch tương đậu nành. [45]
Nguyễn Thị Cẩm Vy (2010), đã phân tích thành phần dịch tương đậu nành và được trình bày ở bảng 1.5 như sau:
Bảng 1.5. Thành phần hóa học của dịch tương đậu nành và sữa đậu nành[37]
Thành phần Dịch tương đậu nành Sữa đậu nành
Nitơ tổng (g/l) 2,8 3,6
Lipid % 0,34 0,47
Đường khử (g/l) 1,373 2,0
Protein (g/l) 6,696 6,984
Nitơ formol (g/l) 1,32 1,37
Bên cạnh đó, dịch tương đậu nành chứa nhiều loại acid amin. Xét trong 100g protein của các thành phần thu được trong quá trình làm đậu phụ thì hàm lượng một số loại acid amin có trong dịch tương đậu nành lần lượt là: lysine 8,56g; leucine 3,89g; valine 2,65g… [55]
Các nghiên cứu tận dụng dịch tương đậu nành:
Ben Ounis & cộng sự (2007) sử dụng dịch tương đậu nành đã qua lọc điện thu hồi protein và khoáng chất để nuôi Lactobacillus plantarum LB17. [73]
Vaideki T. S (2005), đã sử dụng màng siêu lọc để thu hồi đường, protein, isoflavine. [73]
Nguyễn Thị Cẩm Vy (2010), đã nghiên cứu chế biến thức uống chức năng từ dịch tương đậu nành và sữa đậu nành. [37]
Vi khuẩn lactic ngoài khả năng lên men lactic, chúng còn có khả năng sản sinh ra các chất kháng sinh gọi là bacteriocin và được ứng dụng nhiều trong bảo quản thực phẩm. [10], [20].
Một số ứng dụng khác
Chế biến thực phẩm: các vi khuẩn lactic được dùng để sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa. Trong sản xuất các loại sữa chua đều có sử dụng quá trình lên men lactic. Nhờ có quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic mà casein được kết tủa, tạo cho sản phẩm có hương vị đặc trưng. Người ta bổ sung calcilactate vào thành phần sữa bột dinh dưỡng, bánh ngọt… để tăng lượng calci cho cơ thể. Trong nông
nghiệp, ứng dụng vi khuẩn lactic để ủ chua thức ăn gia súc do trong quá trình lên men, ngoài sản phẩm acid lactic còn có một số chất có giá trị như chất thơm, vitamin, kháng sinh,…nên thức ăn gia súc ủ chua rất có giá trị về mặt dinh dưỡng, góp phần tăng năng xuất vật nuôi. Sử dụng VK lactic để sản xuất các chế phẩm probiotic, khi đưa probiotic vào đường tiêu hóa của gia súc, gia cầm, các VSV có lợi sẽ nhanh chóng phát triển, nhân nhanh số lượng, tạo môi trường acid ở ruột non và ruột già, tiết ra các chất kháng sinh làm ức chế VSV có hại, hạn chế các bệnh đường ruột. [20]
1.4.3. Vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens 1.4.3.1. Vị trí phân loại 1.4.3.1. Vị trí phân loại Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus
Loài: Bacillus amyloliquefaciens [70]
1.4.3.2. Đặc điểm sinh học
Trực khuẩn nhỏ, thẳng, kích thước 0,5-2,5 x 1,2-10µm, thường xếp thành cặp đôi hay chuỗi ngắn, 2 đầu tế bào tròn hoặc hơi vuông. Bào tử hình bầu dục có kích thước 0,9-0,6µm.
Là trực khuẩn gram dương, catalase dương tính, hiếu khí, khi còn non di động bằng tiêm mao, già tiêm mao rụng nên mất khả năng di động. Khuẩn lạc khô, hoặc nhớt, màu trắng xám hay trắng đục, hơi nhăn có mép lõm mép lồi, tạo thành lớp màng mịn bám chặt trên bề mặt thạch. [36], [70]
1.4.3.3. Khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của B.amyloliquefaciens
Giới thiệu enzyme protease
Protease là các enzym xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (CO-NH) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự.
-CH - C - N -CH - R O H R’ + H2O - CH - C - OH R O + HN - CH - H R’
Nhiều protease có khả năng liên kết este và vận chuyển acid amin.
Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử quốc tế (1984) đã đề nghị sử dụng thuật ngữ peptidase để chỉ các enzym thủy phân mối liên kết peptide (thuộc phân nhóm E.C 3.4) [69]
Nguồn thu nhận protease
Người ta có thể thu nhận protease từ nhiều nguồn khác nhau: động vật, thực vật và vi sinh vật. Vi sinh vật chính là đối tượng có thể sản xuất enzym nói chung và protease nói riêng với số lượng nhiều và giá thành rẻ.
Protease vi sinh vật có thể được thu nhận từ Bacillus subtilis, B.mesentericus,
B.thermorpoteoliticus. Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích
hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu. Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzym được sử dụng. [52], [56]
Protease thu nhận từ nấm mốc: Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng:
A.oryzae, A.terricola, A.fumigates,…các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả
ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Các protease của nấm hoạt động trong vùng pH khá rộng (pH = 4-11) và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất cao.