que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ một vài ống thạch bào tử khác nhau).
- Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào lọ đựng silicagel. Chú ý silicagel hút nước và sinh nhiệt do đó việc đưa dịch bào tử vào phải được thực hiện trong chậu nước đá. Lượng dịch bào tử đưa vào không vượt quá 1/3 thể tích hạt silicagel trong lọ. Sau đó dùng tay lắc đều đảm bảo các hạt silicagel đều dính dịch bào tử nấm sợi. Dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như số mã chủng, ngày bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp...
- Lọ silicagel được đậy nắp cẩn thận nhưng không vặn chặt (nới 1,5 vòng) sau đó giữ trong bình hút ẩm (độ ẩm 35-40%), 25OC trong 1 tuần. Vặn chặt nút và quấn giấy parafil giữ trong 4OC.
Kiểm tra độ sống sót sau khi bảo quản:
Mẫu silicagel ở 4 °C, dùng que cấy vô trùng lấy ra 3 hạt silicagel để trên mặt thạch môi trường mầm thóc (Maltagar), lắc đều cho hạt silicagel tiếp xúc lên mặt môi trường. Để ở nhiệt độ thích hợp, kiểm tra tra khuẩn lạc nấm theo thời gian thích hợp.
Bảo quản nấm sợi có bào tử theo phương pháp đông khô (freez-drying):
Chuẩn bị:
- Ống đông khô rửa sạch (sonic cleaner) trong 15 phút sau đó khử trùng 170OC trong 3 giờ. - Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt (115OC/20 phút).
- Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (10-15 ngày).
Cách tiến hành:
- Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml sữa thanh trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ một vài ống thạch bào tử khác nhau).
- Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 - 0,3 ml), thông thường chuẩn bị 13 ống cho mỗi chủng. Dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như mã số chủng, ngày bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp. Sau đó đậy bằng nút bông hay giấy bạc.
- Giữ ở -80°C trong 3 giờ trước khi tiến hành đông khô, đồng thời bật máy Dura-Stop, khi nhiệt độ đạt - 40OC, đưa mẫu vào tủ đông khô của Dura-Stop, bật máy Dura-Dry, khi mức độ chân không đạt 45 minitor, nhiệt độ -55OC, tăng nhiệt độ Dura-Stop lên -5OC, để qua đêm.
- Tăng nhiệt độ Dura-Stop lên 25°C, khi đạt nhiệt độ cần thiết, tắt máy hút chân không nhưng không tắt Dura-Dry.
- Tắt Dura-Stop, lần lượt nối tube mẫu vào hệ thống manifold, bật máy Dura-Dry, tiến hành hàn ống khi độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55OC.
- Tiến hành các bước 1,2,3,4 như trên.
- Mẫu được để tiền đông khô ở -80°C trong 3 giờ. Bật máy Dura-Dry, khi đạt nhiệt độ -60oC đến -55oC, độ chân không 45 minitor, gắn ống mẫu với hệ thống manifold tiến hành hàn ống khi độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55oC.
Kiểm tra độ sống sót sau khi đông khô:
- Mở ống đông khô bằng cách đốt nóng đầu hàn trên đèn cồn và làm lạnh đột ngột bằng cồn đốt.
- Dùng pipet pasteur lấy khoảng 1ml nước cất vô trùng từ ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất vô trùng làm tan đều mẫu đông khô. Hút toàn bộ dịch huyền phù sang ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất. Trộn đều và nhỏ vào 3 vị trí khác nhau (mỗi vị trí 3 giọt) trên môi trường thạch đĩa thích hợp và nghiêng cho dịch chảy đều dọc theo một hướng như hình vẽ: