Thái Nguyên và Bắc Giang bằng phương pháp sinh học phân tử
Giới thiệu chung
Hiện nay, phương pháp PCR đã được ứng dụng trong chẩn đoán các tác nhân gây bệnh, ngay cả các vi sinh vật không thể phát hiện được bằng các xét nghiệm khác.
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985. Ðây là phương pháp in vitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các bản sao từ một trình tự DNA đặc biệt dựa trên hoạt động của enzyme polymerase. Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA mới từ mạch khuôn. Tất cả các DNA polymerase đều cần mồi, đây là những đoạn DNA ngắn (20 – 30 nucleotide) có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn (template). Ðoạn mồi này sau đó sẽ được kéo dài nhờ hoạt động của Taq DNA polymerase để hình thành một mạch DNA mới hoàn chỉnh.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn.
- Giai đoạn biến tính (denaturation): tách chuỗi DNA từ mạch đôi (chuỗi xoắn kép) thành dạng mạch đơn.
- Giai đoạn bắt cặp (annealing): gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung. - Giai đoạn kéo dài chuỗi (extension): tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc.
+ Các thành phần tham gia phản ứng PCR
Khuôn DNA (nucleic acid đích/chuỗi acid nucleic)
Phản ứng PCR là thử nghiệm nhân bản (khuếch đại) một đoạn DNA đích trong một ống nghiệm loại nhỏ (0,2 µl hoặc 0,5 µl ) dựa vào các chu kỳ nhiệt và cặp mồi để tạo ra một số lượng lớn các bản sao DNA nhờ vào máy luân nhiệt (thermal cycle) hay còn gọi là máy PCR.
Primer hay đoạn mồi
Mồi là những đoạn DNA đơn (oligonucleotide) có kích thước chỉ vài chục base (18 - 30 nucleotide), có thể bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc của chuỗi DNA đích khi chuỗi đích này được biến tính thành sợi đơn. Trong phản ứng PCR, đoạn mồi có hai vai trò chính: (i) Quyết định tính đặc hiệu của
thử nghiệm, vì nếu đoạn mồi được chọn càng đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không thể bắt cặp được trên các chuỗi DNA khác ngoài chuỗi đích thì sản phẩm PCR càng đặc hiệu. (ii) Khởi động enzyme polymerase vì enzyme polymerase chỉ có thể bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung cho chuỗi DNA đích khi vị trí mồi được bắt cặp ở đầu 3', đây là đầu mà enzym xúc tác cho một dNTP được gắn vào khi chuỗi DNA đang ở tình trạng sợi đôi. Thông thường trong phản ứng PCR, người ta dùng một cặp mồi, trong đó một mồi xuôi gọi là forward primer và một mồi ngược gọi là reverse primer. Cặp mồi này quyết định kích thước của sản phẩm PCR.
dNTP (deoxy nucleoside triphosphate)
dNTP là đơn vị để có thể tổng hợp được các bản sao của DNA đích. dNTP có cấu tạo gồm một đường deoxyribose có gắn một base, có thể là adenine (dATP) hay thymine (dTTP) hay Cytosine (dCTP) hay guanine (dGTP) , ở carbone số 1(C1). Ba phân tử phosphate (triphosphate) được gắn tại vị trí carbone số 5 (C5) của phân tử deoxyribose này và đây chính là nơi mà dNTP gắn vào đầu 3' của chuỗi bổ sung trên chuỗi đích. Năng lượng để cho phản ứng này xảy ra được lấy từ các nối phosphate giàu năng lượng của triphosphate trên dNTP. Ðó cũng chính là lý do tại sao phải là dNTP không phải là dNDP (diphosphate) hay dNMP (monophosphate).
Enzym polymerase và dung dịch đệm cho phản ứng PCR
Thường dùng nhất trong các phòng thí nghiệm là enzyme Taq polymerase, đây là enzym được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus, là một vi khuẩn chịu nhiệt sống được trong các suối nước nóng.
Đệm Tris HCl 10 mM, KCL 50 Mm và MgCl2. Ngoài ra, dung dịch đệm PCR còn có thể chứa 0,001% BSA hay Gelatine và trong một số phản ứng PCR còn có thể thêm Tween, Dimethyl sulfoxide (DMSO) hay formamide... Trong các thành phần trên, ảnh hưởng đến chất lượng của PCR nhiều nhất là nồng độ MgCl2. Vì vậy để có được một phản ứng PCR có độ nhạy cao và đặc hiệu, cần phải tối ưu hóa MgCl2 từ 1,5 mM đến 5 mM để thăm dò, xác định được nồng độ tối ưu nhất.
Nguyên liệu
Mẫu bệnh phẩm là gan và manh tràng của gà mổ khám tại Thái Nguyên và Bắc Giang có triệu chứng, bệnh tích điển hình của bệnh đầu đen.
Các mẫu bệnh phẩm được lấy tươi và bảo quản trong cồn 70o, đưa về Viện Công nghệ sinh học ngay trong ngày để tách DNA tổng số.
Mẫu bệnh phẩm gồm 3 cặp mẫu (mỗi cặp gồm mẫu gan và mẫu manh tràng) thu thập trên gà mắc bệnh tại hai tỉnh Thái Nguyên và Bắc Giang.
Cặp mẫu 1:
Mẫu gan: ký hiệu Hm-H1-TN-VN (Hm = Histomonas; H1 = Hepatitis) Mẫu manh tràng: ký hiệu Hm-C1-TN-VN (Hm = Histomonas; C1 = Ceaca) Cặp mẫu 2:
Mẫu gan: ký hiệu Hm-H2-BG-VNi Mẫu manh tràng: ký hiệu Hm-C2-BG-VN Cặp mẫu 3:
Mẫu gan: ký hiệu Hm-H3-TN-VN Mẫu manh tràng: ký hiệu Hm-C3-TN-VN Xử lý mẫu:
Mẫu gan: Mẫu được bảo quản trong cồn, cần phải loại bỏ bớt nồng độ cồn trong mẫu. Cắt một mẩu gan (~ 25 mg) ở vị trí bệnh tích điển hình (có dạng hình hoa cúc), cắt nhỏ trên lam kính, chuyển mẫu vào ống eppendorf 1,5 ml, rửa nước 3 lần, ngâm nước qua đêm trong ngăn mát để ngày hôm sau tách DNA.
Mẫu manh tràng: cắt dọc manh tràng để bỏ phân, rửa bằng nước cất khử trùng cho sạch phân, cạo lớp niêm mạc phía trong manh tràng để tách DNA.
Phương pháp tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số được tách chiết từ các mẫu trên, sử dụng bộ sinh phẩm QIAamp DNA Mini kit (hãng QIAGEN Inc, Mỹ). Theo hướng dẫn của nhà sản xuất: các mẫu được nghiền nát thành huyễn dịch, đồng nhất bằng bộ cối chày nhựa dùng 1 lần. Bổ sung 180 μl ATL + 20 μl Pro.K + 4 μl RNaseA. Ủ 55oC, thời gian 2 giờ. Vortex mẫu 30 phút/1 lần. Sau đó bổ sung 200 μl AL. Ủ 70oC/30 phút. Dùng pipetman (loại 1000 μl) chuyển dịch các mẫu sang các cột lọc (màng lọc) của bộ kit trên. Ly tâm 13.000 vòng/1 phút. Bổ sung 500 μl AW1. Ly tâm 13.000 v/1 phút. Bỏ nước phía dưới của cột lọc. Bổ sung 500 μl AW2. Ly tâm 13.000 v/ 1 phút (2 lần) để làm khô màng lọc. Bổ sung 100 μl AE. Để ở nhiệt độ phòng thời gian 2 phút. Ly tâm thu DNA tổng số.
Thực hiện kỹ thuật PCR để thu nhận chuỗi gen 18S ribosomal
Kỹ thuật PCR được thực hiện để thu nhận gen 18S có độ dài khoảng 0,6 kb. (Grabensteiner và cs., 2006 [47]), sử dụng bộ kit PCR Master mix (Fermentas). Thành phần phản ứng PCR thực hiện với khuôn DNA tổng số có chứa DNA của
Histomonas, được hỗn hợp trong ống PCR (ống plastic chịu nhiệt, có dung tích 0,2 μl), bao gồm các dung môi của phản ứng (PCR master mix), mồi xuôi, mồi ngược, nước và khuôn, tổng thể tích là 50 μl. Cụ thể như sau:
TT Tên phản ứng Mồi Thể tích Độ dài dự kiến
1 HmC1pcr352 HMF – HMR 50 ul ~ 600 bp 2 HmH1pcr353 HMF – HMR 50 ul ~ 600 bp 3 HmC2pcr354 HMF – HMR 50 ul ~ 600 bp 4 HmH2pcr3555 HMF – HMR 50 ul ~ 600 bp 5 HmC3pcr356 HMF – HMR 50 ul ~ 600 bp 6 HmH3pcr357 HMF – HMR 50 ul ~ 600 bp Thành phần PCR Thành phần PCR Thể tích PCR master mix 25µl
Mồi xuôi (10pmol) (HMF) 2 µl
Mồi ngược 1 (10pmol) (HMR) 2 µl
Khuôn 3 µl
DMSO 2 µl
Nước 16 ul
Tổng 50 µl
Chu trình nhiệt
Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
940C 5 phút 1 940C 1 phút 35 500C 30 giây 720C 1 phút 720C 10 phút 1
Phương pháp giải trình tự và xử lý số liệu
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được giải trình tự trực tiếp. Chuỗi nucleotide được xử lý bằng ChromasLITE v2.01; truy cập Blast tại địa chỉ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST để thu nhận các chuỗi gen 18S ribosomal tương đồng có trong Ngân hàng gen. So sánh đối chiếu trình tự nucleotide của gen 18S bằng chương trình GENEDOC2.7 http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/; khảo sát mức độ tương đồng nucleotide và mối quan hệ phả hệ, sử dụng chương trình MEGA6.06, phương pháp „kết nối liền kề‟ NJ (Neighbor – Joining) với hệ số tin tưởng (bootstrap) 1000 lặp lại (Tamura và cs., 2013 [120]).