3.4.2.1. Nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ nuôi cấy là một trong những yếu tố của MT có ảnh hưởng mạnh đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp của vsv. Do đó, việc xác định nhiệt độ tối ưu cho sự tạo sinh khối là cần thiết. Để xác định nhiệt độ nào thích hợp cho sự gia tăng sinh khối tế bào của 3 chủng B, N4, L2, chúng tôi tiến hành nuôi cấy 3 chủng trên ở các nhiệt độ 25°c, 30°c, 35°c, 40°c, 45°c, 50°c. Xác định mật độ tế bào trên máy quang phổ ở bước sóng 600 nm trong thời gian từ 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48 giờ. Kết quả được trình bày trong bảng 3.10 và biểu diễn trên đồ thị 3.4 và 3.5.
* Nhận xét
Ở đây, nhận thấy sự sinh trưởng, phát triển của các chủng phụ thuộc rõ rệt vào nhiệt độ. Khả năng này tốt nhất trong dãy nhiệt độ 30°c - 40 °c. Mật độ tế bào của 3 chủng đạt ở mức cao (OD600> 1,375) sau 24 giờ nuôi cấy. Tuy nhiên, tốc độ tăng trưởng của các chủng không đều nhau. Kết quả trên cho thấy, ở 25°c, pha log đến chậm sau 6 giờ đối với cả 3 chủng (OD600< 0,394).
Ở nhiệt độ 35°c, chủng B và N4 có tốc độ phát triển rất nhanh, sau 12 giờ nuôi cấy mật độ tế bào gần ở mức cực đại (OD600 > 2,000) và phát triển ổn định ở mức cao trong thời gian lên men tiếp theo. Điều đó có lẽ là do khả năng thích nghi nhanh chóng của chúng với MT ở nhiệt độ này. Còn ở 30°c mật độ tế bào của 2 chủng B, N4 chênh lệch không đáng kể so với khi phát triển ở 35°c.
Đối với chủng L2, mật độ tế bào thấp nhất ở 25°c (OD600= 0,623) và đạt giá trị cao trong khoảng nhiệt độ từ 35°c - 40°c (OD600 > 1,738) sau 24 giờ nuôi cấy. Đặc biệt ở 40°c tốc độ phát triển của chủng L2 cao nhất và đạt giá trị cực đại
(OD600> 1,896) sau 36 giờ nuôi cấy. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của Vũ Hồng Thắng (1998) và Võ Thị Thứ (2003).
Tóm lại, qua các kết quả trên chúng tôi nhận thấy :
+ Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng sinh khôi tế bào của chủng B và N4 là từ 30°c - 35°c. + Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng sinh khối tế bào của chủng L2 là 35°c - 40°c.
Đây là các khoảng nhiệt độ gần với nhiệt độ cơ thể (37°C), thích hợp cho sự phát triển của hầu hết các chủng vsv. Đặc điểm này có lợi cho việc sử dụng các chủng vào sản xuất chế phẩmprobiotic để phòng và trị bệnh đường ruột cho heo.
3.4.2.2. pH ban đầu
Trị số pH ban đầu ương MT có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp của vsv. Đối với VK lactic thì đây là một đặc điểm rất quan trọng vì sự sinh trưởng của chúng phụ thuộc rất nhiều vào pH.
Để xác định ảnh hưởng của pH ban đầu đến sự tạo thành sinh khôi của các chủng VK lactic trên, pH MT được điều chỉnh đến các giá trị 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 và 7,5 bằng NaOH I N và CH3COOH IN. Xác định giá trị OD600 tại thời điểm từ 0 - 48 giờ.
Kết quả được trình bày ương bảng 3.11 và biểu diễn trên đồ thị 3.6.
* Nhận xét
Qua kết quả trên, chúng tôi nhận thây 2 chủng B và N4 có thể phát triển ở khoảng pH rộng từ 5,5 đến 7,5, tốc độ sinh trưởng của chúng ương khoảng pH từ 5,5 đến 7,5 không khác nhau nhiều.
Ở pH 6,5 tốc độ sinh trướng của chúng ổn định hơn và mật độ tế bào gần ở mức cực đại sau 12 giờ nuôi cấy (OD600> 2,000).
Như vậy, pH ban đầu tối ưu cho sự tăng sinh khối tế bào của chủng B và N4
trong khoảng từ 6,0 - 6,5. OpH 5.0 ■ pH 5.5 □ pH 18 24 30 36
Thời gian (giờ)
Đồ thị 3.6. Ảnh hường của pH ban đầu đến sự tạo thành sinh khôi của chủng L2
Chủng L2 có thể phát triển trong khoảng pH từ 5,0 đến 6,5, trong khoảng pH này tốc độ sinh trưởng của chúng khá ổn định. Ở pH 5,5 tốc độ sinh trưởng của chủng L2 ổn định hơn và mật độ tế bào gần ở mức cực đại sau 24 giờ nuôi cấy (OD600>1,678).
Như vậy, pH ban đầu tối ưu cho sự tăng sinh khối tế bào của chủng L2 trong khoảng từ 5,5 - 6,0. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của Vũ Hồng Thắng (1998).
Theo chúng tôi, pH ban đầu của MT có vai trò quan trọng, góp phẫn tạo điều kiện thuận lợi cho VK trong giai đoạn đầu của quá trình đồng hoa và tổng hợp các chất cần thiết. Do đó có ảnh hưởng rõ rệt đến sự tạo thành sinh khối VK.
Chúng tôi nhận thấy cả 3 chủng đều phát triển tốt ở khoảng pH khá rộng Lừ 5,5 đến 7,5. Điều này rất có lợi bởi cho phép chúng có thể phát triển tốt ở nhiều MT sống khác nhau. Trong cùng MT, khi VK lactic tồn tại và phát triển được ở pH kiềm sẽ có khả năng ức chế, tiêu diệt VK gây thối, gây bệnh.
3.4.2.3. Nguồn thức ăn nitơ
Quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp của VK lactic rất cần những cơ chất hữu cơ phức tạp chứa nitơ như các sản phẩm thúy phân protein từ thịt, cao nấm men, pepton, ... Nitơ ở dạng axit amin hoặc peptit là nguồn dinh dưỡng rất quan trọng cho sự tạo thành sinh khối tế bào của VK lactic.
Để khảo sát vai trò của các nguồn nitơ đối với sự sinh trưởng và sinh tổng hợp của các chủng B, N4, L2 trong MT nước chiết cà chua, chúng tôi sử dụng các nguồn nitơ là cao nám men, dịch chiết nấm men, cao thịt, pepton.
Xác định giá trị ODeoo tại thời điểm từ 0 - 48 giờ. Kết quả được trình bày trong bảng 3.12 và biểu diễn trên đồ thị 3.7, 3.8, 3.9.
* Nhận xét
Khi thay đổi nguồn nitơ trong thành phần MT nuôi cấy thì tốc độ sinh trưởng của ba chủng VK nói trên có sự thay đổi đáng kể. Cả ba chủng B, N4, L2 đều phát triển tốt trong MT có nguồn nitơ là cao nấm men, mật độ tế bào gần ổ mức cực đại sau 24 giờ nuôi cấy (OD600 > 1,860), so với cao thịt (OD600 > 1,045), dịch chiết nấm men hoặc pepton (OD600> 0,687). Nguyên nhân do thành phần cao nấm men có nhiều chất hữu cơ phức tạp, rất cần cho sự tạo thành sinh khối tế bào của các chủng VK lactic.
Như vậy, sau MT MRS có thể chọn MT cà chua với nguồn nitơ cao nấm men là MT nghiên cứu sự tạo thành sinh khối của 3 chủng VK lactic trên. Kết quả nghiên cứu
của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của Vũ Hồng Thắng (1998) và Võ Thị Thứ (2003).
3.4.2.4. Nồng độ cao nấm men
Để xác định nồng độ cao nấm men thích hợp, chúng tôi nuôi cấy ba chủng VK trên trong MT nước chiết cà chua có bổ sung 0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5% cao nấm men. Xác định giá trị OD600 tại thời điểm từ 0 - 48 giờ. Kết quả được trình bày trong bảng 3.13 và biểu diễn trên đồ thị 3.10.
* Nhận xét
Khi thay đổi nồng độ cao nấm men từ 0,5% đến 2,5% thì tốc độ phát triển của hai chủng Lactobacillus sp. B, Lactobacillus sp. N4 không thay đổi nhiều, mật độ tế bào gần ở mức cực đại (OD600> 2,000) sau 24 giờ nuôi cấy ở nồng độ 1,5% cao nấm men, mật độ tế bào của hai chủng B, N4 có sự chênh lệch không đáng kể so với các nồng độ còn lại.
Với chủng L2, tóc độ sinh trưởng tăng rõ rệt ở nồng độ cao nấm men từ 2,0% đến 2,5% (OD600 > 2,005) sau 24 giờ nuôi cấy. ở nồng độ từ 0,5% đến 1,5% tốc độ sinh trưởng chậm hơn.
Tóm lại qua các kết quả trên chúng tôi nhận thấy :
+ Nồng độ cao nấm men tối ưu cho sự tăng sinh khối tế bào của chủng B và từ 1% - 1,5%.
+ Nồng độ cao nấm men tối ưu cho sự tăng sinh khối tế bào của chủng L2
từl%-2,0%.
Như vậy, để thu sinh khối tế bào của các chủng VK lactic trên có thể sử dụng MT nước chiết cà chua với nguồn nitơ cao nấm men với hàm lượng từ 1 % đến 2% là phù hợp.
3.4.2.5. Nguồn thức ăn cacbon
Người ta thường dùng đường để làm nguồn thức ăn cacbon khi nuôi cấy phần lớn các vsv dị dưỡng, nên mục đích của thí nghiệm này là nhằm xác định nguồn đường thích hợp nhất, rẻ tiến nhất cho sự gia tăng sinh khối tế bào của ba chủng B, N4, L2.
Ba chủng VK trên được nuôi cây với các nguồn đường như glucose, saccharose, maltose, galactose, lactose, ở các điều kiện tối ưu đã được khảo sát.
Xác định giá trị OD600 tại thời điểm từ 0 - 48 giờ. Kết quả được trình bày trong bảng 3.14 và biểu diễn trên đồ thị 3.11.
* Nhận xét
Trong các loại đường được khảo sát, tốc độ tăng trưởng của cả ba chủng không thay đổi nhiều, mật độ tế bào của chúng chênh lệch không đáng kể. Điều này chứng tỏ các chủng VK được khảo sát có khả năng sử dụng được nhiều loại đường khác nhau.
Như vậy, có thể sử dụng saccharose thay thế cho glucose ương quá trình lên men thu sinh khối, nhằm làm giảm giá thành khi sản xuất chế phẩm.
3.4.2.6. Nồng độ saccharose
Với mục đích xác định nồng độ đường saccharose thích hợp, chúng tôi tiến hành nuôi cấy ba chủng B, N4, L2 trên MT nước chiết cà chua có bổ sung 0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5% saccharose. Xác định giá trị OD600 tại thời điểm từ 0 - 48 giờ. Kết quả được trình bày trong bảng 3.15 và biểu diễn trên đồ thị 3.12.
* Nhận xét
Khi thay đổi nồng độ saccharose từ 0,5% đến 2,5%, tóc độ phát triển của hai chủng B, N4 không thay đổi nhiều, mật độ tế bào gần ở mức cực đại sau 24 giờ nuôi cấy (OD600 > 2,000). Chúng tôi nhận thấy ở nồng độ 1,5% saccharose, mật độ tế bào của hai chủng B, N4 tăng rõ rệt so với các nồng độ còn lại.
Đối với chủng L2, tốc độ sinh trưởng tăng rõ rệt ỏ nồng độ saccharose từ 1,0% đến 2,5%, mật độ tế bào gần ở mức cực đại sau 24 giờ nuôi cấy (OD600 > 1,427), ở nồng độ 0,5% tốc độ sinh trưởng chậm hơn.
Như vậy, để thu sinh khối các chủng VK khảo sát trong MT nước chiết cà chua có thể dùng nồng độ saccharose từ 1 - 1,5% với chủng B, N4 và 1 - 2% với chủng L2 là phù hợp.
Qua các kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện MT đến khả năng tạo sinh khối tế bào của 3 chủng B, N4, L2, có thể xác định được các điều kiện tôi ưu cho sự tạo thành sinh khôi của 3 chủng như sau :
+ MT nước chiết cà chua.
+ Nhiệt độ từ 30°c - 35°c (B và N4); 35°c - 40°c (L2). + pH ban đầu là 6 - 6,5 (B và N4); 5,5 - 6,0 (L2).
+ Nồng độ cao nấm men là 1,0 - 1,5% (B và N4); 1,0 - 2,0% (L2). + Nồng độ saccharose là 1,0 - 1,5% (B và N4); 1,0 - 2,0% (L2).