trưởng của vỉ khuẩn lactic bằng phương pháp đo mật độ quang
Sự tăng trưởng của giống vsv có thể được biểu diễn bằng sự gia tăng mật độ tế bào (N/ml) hay sự gia tăng sinh khối giống theo thời gian nuôi cấy. Để theo dõi sự gia tăng mật độ tế bào theo thời gian nuôi cấy, có thể xác định một cách gián tiếp thông qua đo mật độ quang của dịch nuôi cấy.
Nguyên tắc
vsv trong MT nuôi cấy có thể hấp thu hoặc phân tán ánh sáng làm cho ánh sáng truyền suốt bị giảm. Do đó, số lượng ánh sáng được hấp thu hoặc phân tán (độ đục) có mối tương quan thuận với số lượng vsv trong dịch nuôi cấy. Độ đục này chính là giá trị
OD đo được tại bước sóng 600 nm trên máy quang phổ (Thực chất phương pháp này dựa trên sự tương quan tuyến tính giữa OD600 và logarit mật độ tế bào (N/ml)).
Phương pháp
Nhân giống : Bổ sung 1% (v/v) giống vào các ống nghiệm chứa lo mi MT MRS dịch thể, nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp cho từng chủng trong 24 giờ.
Bổ sung 1% (v/v) dịch nhân giông vào các ông nghiệm chứa các loại MT nuôi cấy cần khảo sát. Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Tiến hành đo OD600 tại các thời điểm : 0; 1; 2; 3; 6; 12; 18; 24; 30; 36; 42; 48 giờ. Tiến hành đo lặp lại 3 lần ở 3 ống nghiệm khác nhau, sau đó lấy giá trị trung bình của 3 lần đo.
Dựa vào giá trị OD600 đo được và số khuẩn lạc đếm được ở mỗi giá trị OD600 tương ứng, suy ra mật độ tế bào tương ứng với các giá trị OD600 ở các thời điểm khác nhau. Xác định số lượng tế bào ứng với mỗi giá trị OD600 đo được. Từ đó vẽ đồ thị sinh trưởng của các chủng.
2.2.5.1. Ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy [12], [36], [37]
Dùng 5 loại MT khác nhau để khảo sát : MT MRS dịch thể, nước chiết cà chua, nước chiết giá đậu, có chất tăng trưởng, không có chất tăng trưởng.
Các loại vsv khác nhau, nhu cầu dinh dưỡng của chúng khác nhau nên có khả năng phát triển khác nhau trên các MT.
Tiến hành
Nhân giống (giống phần 2.2.5). Bổ sung 1% (v/v) dịch nhân giông vào các ống nghiệm chứa các loại MT nuôi cây khác nhau. Nuôi cây ở nhiệt độ 30°c. Tiến hành đo OD600 tại các thời điểm từ 0 - 48 giờ. Tiến hành đo tương tự như phần 2.2.5. Dựa vào giá trị OD600, chọn ra MT thay thế thích hợp nhằm hạ giá thành khi tạo chế phẩm.
2.2.5.2.Ảnh hưởng của pH ban đầu [12], [13], [36], [37]
Dựa vào khả năng sinh trưởng và phát triển tốt nhất của vsvtrong MT thích hợp với các nồng độ pH khác nhau.
Tiến hành
Nhân giống (giống phần 2.2.5). Chuẩn bị các ống nghiệm lớn chứa 20ml MT nước chiết cà chua. Chỉnh pH ban đầu bằng NaOH 1N và CH3COOH 1 N về các giá trị pH khác nhau : 3,5; 4; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7; 7,5. Bổ sung 1% (v/v) dịch nhân giống vào các ống nghiệm chứa các loại MT ứng với từng giá trị pH trên. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 30°c. Tiến hành đo OD600 tại các thời điểm từ 0 -48 giờ. Dựa vào giá trị OD600, có thể xác định được pH ban đầu nào tối ưu cho sự sinh trưởng của các chủng VK.
2.2.5.3.Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy [12], [13], [36], [37]
Mỗi nhóm vsv sẽ phát triển tốt ở nhiệt độ thích hợp và bị ức chế không phát triển ở nhiệt độ không thích hợp.
Nhân giống (giống phần 2.2.5). Chuẩn bị các ống nghiệm lớn chứa 20ml MT nước chiết cà chua. Bổ sung 1% (v/v) dịch nhân giông vào các ống nghiệm trên. Nuôi cấy tĩnh ở các nhiệt độ khác nhau : 25°c, 30°c, 35°c, 40°c, 50°c. Tiến hành đo OD600 tại các thời điểm từ 0 - 48 giờ. Dựa vào giá trị OD600, có thể xác định được ở nhiệt độ nào tối ưu cho sinh trưởng của các chủng VK.
2.2.5.4.Ảnh hưởng của các nguồn thức ăn nitơ đến sự tạo thành sinh khối [12], [13], [36], [37]
Căn cứ vào khả năng phát triển của các chủng VK trên MT có nguồn nitơ khác nhau sẽ cho giá trị OD khác nhau.
Tiến hành
Nhân giống (giống phần 2.2.5). Chuẩn bị các ông nghiệm lớn chứa 20ml MT nước chiết cà chua với các nguồn nitơ : cao nấm men, dịch chiết nấm men, pepton. Bổ sung 1% (v/v) dịch nhân giống vào các ống nghiệm trên. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ thích hợp cho từng chủng. Tiến hành đo OD600 tại các thời điểm từ 0-48 giờ. Dựa vào giá trị OD600, có thể xác định được nguồn nitơ thích hợp cho sinh trưởng của các chủng VK.
2.2.5.5. Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men [12], [13], [36], [37]
Căn cứ vào khả năng phát triển của các chủng VK trên các MT có nồng độ cao nấm men khác nhau sẽ cho giá trị OD khác nhau.
Tiến hành
Nhân giống (giông phần 2.2.5). Chuẩn bị các ống nghiệm lớn chứa 20ml MT nước chiết cà chua với các nồng độ cao nấm men tương ứng : 0,5%; 1%; 1,5%; 2,0%; 2,5%. Bổ sung 1% (v/v) dịch nhân giống vào các ống nghiệm tương ứng với các nồng độ trên. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ thích hợp cho từng chủng. Tiến hành đo OD600 tại các thời điểm từ 0 - 48 giờ. Dựa vào giá trị OD600, có thể xác định được nồng độ cao nấm men thích hợp cho từng chủng VK.
2.2.5.6. Ảnh hưởng của các nguồn thức ăn cacbon đến sự tạo thành sinh khối [12], [13], [36], [37]
Căn cứ vào khả năng phát triển của các chủng VK trên các MT có nguồn cacbon khác nhau sẽ cho giá trị OD khác nhau.
Tiến hành
Nhân giống (giông phần 2.2.5). Chuẩn bị các ống nghiệm lớn chứa 20ml MT nước chiết cà chua với các nguồn cacbon : glucose, saccharose, maltose, galactose, lactose. Bổ sung 1% (v/v) dịch nhân giống vào các ống nghiệm trên.
Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ thích hợp cho từng chủng. Tiến hành đo OD600 tại các thời điểm từ 0 - 48 giờ. Dựa vào giá trị OD600, có thể xác định được nguồn cacbon thay thế glucose nhằm hạ giá thành khi tạo chế phẩm.
2.2.5.7. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose [12], [13], [36], [37]
Căn cứ vào khả năng phát triển của các chủng VK trên các MT có nồng độ saccharose khác nhau sẽ cho giá trị OD khác nhau.
Tiến hành
Nhân giông (giống phần 2.2.5). Chuẩn bị các ống nghiệm lớn chứa 20ml MT nước chiết cà chua với các nồng độ saccharose tương ứng : 0,5%; 1%; 1,5%; 2,0%; 2,5%. Bổ sung 1% (v/v) dịch nhân giống vào các ông nghiệm trên. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ thích hợp cho từng chủng. Tiến hành đo OD600 tại các thời điểm từ 0; 12; 24; 36; 48 giờ. Dựa vào giá trị OD600, có thể xác định được nồng độ saccharose thích hợp cho sinh trưởng của các chủng VK.