Ở nước ta có các công trình nghiên cứu về lĩnh vực này của Viện Thú y quốc gia như:
+ Yaourt và canh trùng Subtilis dùng trong phòng trị bệnh phân trắng của heo con (Đào Trọng Đạt, Vũ Đình Hưng, 1962).
+ Viên Subtilis để phòng trị các hội chứng nhiễm khuẩn đường ruột của gia súc (Lê Thị Tài và cộng sự, 1968 - 1978).
+ Chế phẩm vsv (Saccharomyces boulardi) với bệnh phân trắng heo con (Phan Thanh Phượng và cộng sự, 1968 - 1978).
+ Chế phẩm Biolactyl để phòng trị bệnh đường ruột của heo (Phan Thanh Phượng và cộng sự, 1979 - 1984).
+ Chế phẩm Biol để phòng trị bệnh đường ruột của heo (Viện Sinh học nhiệt đới TP. HCM, 2003).
Các nghiên cứu trên đều khẳng định kết quả phòng trị bệnh đường ruột ở heo và tác dụng điều tiết kích thích sinh trưởng của chế phẩm probiotic.
Năm 2002, Tạ Thị Vịnh và cộng sự đã sử dụng chế phẩm VITOM.l và VITOM.3 của Nga trong phòng trị bệnh đường tiêu hóa trên heo và gà. Kết quả thu được là tăng trọng trên heo tăng 6%, tỉ lệ tiêu chảy phân trắng giảm 11%, tỉ lệ khỏi bệnh đạt 100% và không có tái phát (VITOM.3) ; tăng trọng trên gà tăng 11,8%, tỉ lệ khỏi bệnh đạt 99% (VITOM.l và VITOM.3). Khi so sánh hiệu quả điều trị tiêu chảy trên heo con từ sơ sinh đến 3 tuần tuổi giữa VITOM.1 và các kháng sinh norcoli, octacin, colistin, tác giả ghi nhận tỉ lệ khỏi bệnh ở lô dùng VITOM là 100% và tỉ lệ tái phát 25% trong khi ở lô dùng kháng sinh có tỉ lệ khỏi bệnh 80,7% và tỉ lệ tái phát 52,38%.
Phạm Khắc Hiếu và cộng tác viên (2002), nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của chế phẩm EM 1 trên heo con đã cho thấy phế phẩm EM 1 có tác dụng ức chế đối với E. coli, Saimoneila, Klebsiella, Shigella, Proteus, Staphylococcus, Streptococccus, Clostridium, Sarcina lutea. Kết quả số lượng VK E. coli trong phân giảm, tỷ lệ tiêu chảy giảm và tăng trọng nhanh.
1.4.2. Những nghiên cứu ở nước ngoài
Theo Lema và cộng sự (2001), dùng probiotic cho heo với L. acidophilus (lô 1), Streptococcus faecium (lô 2), hoặc phối hợp giữa L. acidophilus với Streptococcus faecium (lô 3), hoặc giữa L. acidophilus với s. faecium, Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum và L. piantarum (lô 4). Để kiểm tra sự bài thải của VK E. coli Q157, ông đã trộn các VK trên với liều 6xl06
CFU/ kg thức ăn liên tục trong 7 tuần. Kết quả cho thấy lô 4 có sự bài thải VK E. coli trong phân thấp hơn các lô khác. Khác biệt này hoàn toàn có ý nghía so với lô đối chứng không dùng probiotic.
Kyriakis và cộng sự (1999), nghiên cứu ảnh hưởng của probioic LSP 122 đến việc phòng ngừa bệnh tiêu chảy ở heo con giai đoạn 28 ngày tuổi. Thí nghiệm được tiến hành trên 4 lô : lô 1 không dùng probiotic, lô 2 sử dụng VK Bacillus toyoi với liều l06
tế bào/kg thức ăn và lô 4 sử dụng B. lichenì/ormis với liều l06
và l07 tế bào/ kg thức ăn. Kết quả thí nghiệm giữa các lô khác biệt hoàn toàn và có ý nghĩa so với lô đôi chứng (P< 0,05). Ngoài ra, tăng trọng/ ngày, tiêu tốn thức ăn cũng cải thiện hơn so với đối chứng. Trong đó lô sử dụng l07
tế bào B. licheniformis cho kết quả tốt nhất.
Theo Tuomola và cộng sự (1999) làm thí nghiệm dùng các VK probiotic như Lactobacillus GG, L. johnsonii, L. rhamnosus để cạnh tranh vị trí bám dính trên niêm mạc ruột với VK E. coli, s. typimurium, s. enteritidi. Kết quả cho thấy Lactobacillus GG, L, johnsonii và L. rhamnosus làm giảm sự bám dính của E. coli từ 90 - 91% ; riêng s. typhimurium bị giảm khả năng bám dính đến 77% bởi Lactobacillus johsonii và 83% bởi L. casei.
Tóm lại, các công trình nghiên cứu được tóm lược ở trên đã sử dụng các chế phẩm probiotic cho gia súc, gia cầm để ức chế vsv gây bệnh, phòng ngừa và điều trị tiêu chảy, cải thiện tăng trọng và hệ số tiêu tốn thức ăn,... Mặc dù, các công trình nghiên cứu những khía cạnh khác nhau, sử dụng các chế phẩm có thành phần khác nhau nhưng đều có kết luận là probitic có ảnh hưởng có lợi trên vật nuôi.
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Nguyên liệu
Các chủng VK lactic (B, B1 N1, N4, K4 (KC4), K5 (K5.5), C7) trong bộ sưu tập giống của phòng thí nghiệm Vi sinh trường Đại học Sư phạm TP. HCM. L2 trong chế phẩm men tiêu hóa antibio.
Các chủng VK kiểm định : Santeu sp., Streptococcus sp., Bacillus subtilis, B. pimitilis, Prabli sp., Salmonella typhimurium, Sarcina lutea, Serratia sp., Shigella flexneri, Klebsiella sp., Enterococcus sp. do Trung tâm Công nghệ Sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội cung cấp.
E. coli, Salmonella choleraesuis do Viện Pasteur TP. HCM cung cấp. Enzym a -amylase và protease do Viện Sinh học nhiệt đới TP. HCM cung cấp.
2.1.2. Hóa chất
Cao nấm men, cao thịt, sữa gầy, tween 80 (Đức).
Glucose, saccharose, lactose, galactose, maltose, dextrin, sorbitol, pepton, MnS04, NaCl, CaC03, KOH, phenol, axit lactic, phenolphtalein, NaOH, gentian violet, KI (Trung Quốc).
MgS04.7H20, FeCl3, K2HP04, KH2P04, fuchsin kiềm, FeS04, (NH4)3C6H307 (Nhật Bản).
Agar, CH3COONa, cồn, glutamat (Việt Nam).
Đĩa giấy kháng sinh chuẩn do Công ty TNHH Nam Khoa cung cấp. + Tetracycline (Te) : 30 μg + Neomicin (Ne) : 30 μg
+ Ampicillin (Am) : 30 μg + Nalidixic axit (Ng) : 30 μg (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Kanamicin (Kn) : 30 μg + Cloramphenicol (Clo) : 30 μg + Gentamicin (Ge) : 10μg + Ceftazidime (Ce) : 5 μg
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
Tủ sấy, tủ ấm MEMMERT (Đức), nồi hấp vô trùng HUXLEY (Đài Loan), tủ giữ mẫu VESTFROST REETECH (Đan Mạch), máy li tâm thường HETTICH (Đức), máy li tâm lạnh HETTICH (Đức), tủ lạnh, máy đo pH WTW (Đức), kính hiển vi OLYMPUS (Nhật Bản), kính hiển vi chụp hình OLYMPUS (Nhật Bản), kính hiển vi soi nổi OLYMPUS (Nhật Bản), pipetman NICHIGO (Nhật Bản), máy quang phổ SHIMADZU (Nhật Bản), máy đông khô VIRTIS (Mỹ), máy lắc điểu nhiệt GEHARD (Đức), cân điện tử SATURIUS (Đức), tủ cấy (Trung tâm nhiệt đới Việt Nga).
Các dụng cụ trong phòng thí nghiệm : ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác, que gạt, que cây, pipet, đầu typ các loại, đèn cồn, màng lọc millipore (Ø = 0,3 μm), ...
2.1.4. Môi trường * MT cacbonat agar (MT1) MT * MT cacbonat agar (MT1) MT dùng để phân lập VK lactic. Cao thịt 2g Tween 80 0,5ml Glucose lOg
Cao nấm men lOg
Pepton 5g CaC03 5g CH3 COONa 2g Dung dịch muối (*) 0,5ml Thạch 20g Nước cất 100ml pH = 6,8
Thanh trùng trong nồi hấp áp lực ở 121°c trong 20 phút (*) Dung dịch muối MgS04.7H20 4g NaCl 0,2g MnS04. 4H20 2g FeS04 . 7H20 0,2g Nước cất 100ml * MT MRS (De Man-Rogosa-Sharp) (MT2)
Dùng để nuôi cấy, giữ giống và nghiên cứu các đặc điểm sinh lý sinh hóa gồm : MT MRS agar, MRS dịch thể (không có agar).
pH = 6,5 ± 0,2
*MT MPA (Meat extract – Pepton Agar) (MT3) Dùng để nuôi cấy một số chủng VSV kiểm định
Cao thịt 3g
NaCl 5g
Pepton 10g
Thạch 20g
Nước cất 1000ml
Thanh trùng trong nồi hấp áp lực ở 121o
C trong 20 phút *MT nước chiết giá đậu (MT4)
Nước chiết giá đậu 50% thể tích MT
Peton 20g Saccharose 20g K2HPO4 0,2g MgSO4.7H2O 0,58g MnSO4.4H2O 2g Nước cất đủ 1000ml
Thanh trùng trong nồi hấp áp lực ở 121oC trong 20 phút
Dùng 300g giá đậu đun sôi với 100 lít nước cất trong 30 phút, lọc lấy nước trong. *MT nước chiết cà chua (MT5)
Nước cà chua 400ml
Glucose 10g
Cao nấm men 10g
Dung dịch A 5ml
Dung dịch B 5ml
Bổ sung nước cất cho đủ 100ml
Thanh trùng trong nồi hấp áp lực ở 121o
Dung dịch A: K2HPO4 (2,5g), KH2PO4 (2,5g), H2O (250ml) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dung dịch B: MgSO4.7H2O (10g), NaCl (5g), FeSO4.7H2O (5g), MnSO4.4H2O (5g), H2O (250ml)
Dùng 0,5kg cà chua thái nhỏ đun sôi với 0,5 lít nước trong 60 phút lọc lấy nước trong. *MT có chất tăng trưởng (MT6) Glucose 20g Pepton 10g Chất tăng trưởng 8g (Vitamin nhóm B: B2, B3, B6) (NH4)2SO4 1g KH2PO4 1,5g K2HPO4 4g Nước cất 1000ml pH = 7 Hấp 1atm/20 phút
*MT không có chất tăng trưởng (MT7)
Glucose 20g Pepton 10g (NH4)2SO4 1g KH2PO4 1,5g K2HPO4 4g Nước cất 1000ml pH = 7 Hấp 1atm/20 phút *MT thử hoạt tính protease (MT8) Glucose 0,05g
Nước chiết thịt 5ml Gelatin 10g Pepton 0,1g KH2PO4 1,5g K2HPO4 1,5g NaCl 3g Agar 20g Nước cất 1000ml Hấp 1atm/20 phút
*MT thử khả năng di động của VK lactic (MT9)
Cao thịt 5g Pepton 5g Glucose 5g Dịch tự phân nấm men 5% thể tích Tween 80 0.5ml MnSO4.4H2O 0,1g Kali citrat 1g Bromocresol tía 1,6% 2,8ml Agar 15g Nước cất 1000ml pH = 6,5
Thanh trùng trong nồi hấp áp lực ở 121oC trong 20 phút
2.2. Các phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Khả năng sinh axit lactỉc của vi khuẩn lactic
2.2.1.1.Phương pháp cấy chấm điểm [12], [13], [25], [36], [37]
Dựa vào đặc tính của chủng VK lactic trên MT cacbonat agar là CaC03 sẽ tan khi tác dụng với axit lactic tạo nên vòng trong suốt xung quanh mỗi khuẩn lạc.
Phương pháp
Chuẩn bị các đĩa petri chứa MT cacbonat agar vô trùng. Dùng que cấy đầu nhọn trích ly các khuẩn lạc riêng lẻ khác nhau trên thạch nghiêng cấy chấm điểm sang MT cacbonat agar, nuôi ở nhiệt độ phòng. Sau 4 ngày thấy xuất hiện vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc. Vòng trong suốt càng lớn chứng tỏ lượng axit sinh ra càng nhiều.
Xác định khả năng sinh axit lactic bằng hiệu số (D - d, mm). D : Đường kính vòng phân giải CaC03.
d : Đường kính khuẩn lạc VK lactic.
2.2.1.2.Định tính axit lactic bằng thuốc thử uphenmen [12], [13], [36]
Khi axit lactic tác dụng với phenol có trong thuốc thử uphemen sẽ làm thuốc thử có màu xanh dương đậm chuyển sang màu vàng. Sự đổi màu càng rõ thì lượng axit sinh ra càng nhiều.
Phương pháp
Dùng que cấy trích ly các chủng VK đã thuần khiết cấy vào các ống nghiệm chứa 9ml MT MRS dịch thể, nuôi cây tĩnh ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Sau đó đem li tâm để tách tế bào VK, thu dịch trong. Lấy 3ml dịch cho vào ống nghiệm đã chứa sẩn 2ml thuốc thử uphenmen. Tiến hành đồng thời 2 ống nghiệm đối chứng.
Đối chứng (1) : 3ml axit lactic 0,1% + 2ml thuốc thử
Đối chứng (2) : 3ml MRS dịch thể không cấy VK + 2ml thuốc thử.
Quan sát sự đổi màu của thuốc thử để chọn các chủng có khả năng lên men tốt.
2.2.1.3. Định lượng axit lactic bằng phương pháp chuẩn độ Therner [12], [13],[25], [36], [37]
Xác định hàm lượng axit lactic trong dịch lên men bằng dung dịch kiềm chuẩn nhờ có sự đổi màu của thuốc thử phenophtalein.
Phương pháp
Lấy 10 ml dịch lên men, bổ sung 20 ml nước cất và 1 hoặc 2 giọt phenolphtalein 1% trong cồn. Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho đến khi màu hồng xuất hiện bền trong 30 giây thì dừng lại. Đọc số ml NaOH 0,1N đã chuẩn rồi ghi lại. Tính độ axit bằng công thức :
°T = số ml NaOHx 10
% axit lactic = °T x0,009
2.2.2. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sình lý, sinh hóa 2.2.2.1. Các đặc điểm hình thái của vi khuẩn lactic 2.2.2.1. Các đặc điểm hình thái của vi khuẩn lactic (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Quan sát hình thái khuẩn lạc [12], [13], [36] vsv khi phát triển trên bề mặt các MT đặc trưng sẽ hình thành các dạng khuẩn lạc đặc trưng cho loài đó.
Phương pháp
Lấy một ít dịch nuôi cây đã hoạt hóa 24 giờ, pha loãng ở nồng độ cần thiết. Dùng pipet vô trùng lấy 0,1 mi dịch VK nhỏ lên bề mặt MT MRS. Dùng que gạt dàn đều dịch trên mặt thạch. Để trong tủ ấm 30°c trong 2 - 3 ngày. Quan sát và nhận xét các đặc điểm hình thái, màu sắc, kích thước, tính chất bề mặt của khuẩn lạc bằng kính hiển vi soi nổi.
* Quan sát hình thái tế bào Tiêu bản giọt ép [12], [13], [36]
Dùng que cấy lấy một giọt dịch VK đặt vào giữa lam kính. Đặt lamen lên giọt dịch thật nhẹ nhàng tránh tạo thành bọt khí. Đưa tiêu bản lên quan sát dưới kính hiển vi ở bội giác x100. Quan sát hình thái VK, sự sắp xếp tế bào.
Tiêu bản nhuộm Gram [12], [13], [36]
Dựa vào khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iốt, hình thành hai loại phức chất khác nhau.
Loại 1: vẫn giữ nguyên màu sắc của thuốc nhuộm, không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn, vsv dạng này thuộc Gram (+) (hắt màu tím).
Loại 2: Không giữ được màu thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. vsv dạng này thuộc Gram (-) (bắt màu hồng).
Phương pháp
_ Làm vết bôi : Lấy 1 giọt canh trường hoặc một ít khuẩn lạc VK đặt vào giữa phiến kính, dàn đều tạo thành vùng tròn nhỏ, để khô tự nhiên.
_ Cố định vết bôi : Kẹp phiến kính, hơ nhẹ mặt dưới trên đèn cồn vài lần. _ Nhuộm vết bôi :
Đặt miếng giấy thấm lên vết bôi.
Nhỏ thuốc nhuộm tím gentian lên giấy thấm giữ trong một phút. Nhỏ lugol lên vết bôi, giữ trong mội phút.
Rửa bằng cồn 30 giây, sau đó rửa lại bằng nước.
Nhuộm bổ sung tuchsin kiềm 10-30 giây, rửa lại bằng nước. Để khô và xem tiêu bản với vật kính dầu x100. Ghi nhận khả năng bắt màu Gram của VK.
2.2.2.2. Nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hóa
* Khả năng di động [12], [13], [36]
Dựa vào khả năng di chuyển của VK trên MT bán lỏng có chất chị thị màu.
Phương pháp
Nhỏ một giọt dịch có chủng VK nghiên cứu vào giữa đĩa petri trong đỏ cổ chứa 10 - 15 ml MT9. Nuôi ở nhiệt độ phòng 2 ngày sau đổ đem ra quan sát. Nếu VK có khả năng chuyển động thì axit hữu cơ sinh ra sẽ khuếch tán đều về các phía và làm thay đổi
màu của chất chỉ thị trên toàn bộ bề mặt đĩa petri. Nếu VK không có khả năng chuyển động thì sự đổi màu chất chỉ thị chỉ thấy ở xung quanh giọt dịch VK nhỏ vào. Nhận xét sự di chuyển của VK trong MT, từ đỏ xác định khả năng di động của chúng.
* Kiểu hô hấp [12], [13], [36], [37]
Căn cứ vào khả năng sinh trưởng của vsv trong điều kiện cổ nồng độ oxy khác nhau.
Phương pháp
Chuẩn bị các ống nghiệm thạch đứng chứa l0ml MT MRS agar. cấy các chủng VK vào ống nghiệm bằng que cây đầu nhọn theo phương pháp cấy trích sâu. Nuôi ở nhiệt độ 30°c trong 3 ngày. Nhận xét sự sinh trường của VK trong MT, từ đó xác định quan hệ của chúng với oxy.
* Hoạt tính catalase [12], [13], [36], [37]
Dựa vào khả năng sinh catalase và phân giải H202 của các chủng vsv.
Phương pháp
Nuôi 1% (v/v) chủng VK nghiên cứu trong MT MRS dịch thể ở 30°c trong 18 giờ. Nhỏ 1 giọt H202 3% lên sinh khối tế bào của chủng nghiên cứu đã được tách từ dịch nuôi cấy bằng cách ly tâm 3000 vòng/20 phút. Nếu thấy hiện tượng sủi bọt thì chủng VK đó được coi là có hoạt tính catalase, nếu không sủi bọt thì không có hoạt tính catalase. Quan sát hiện tượng sủi bọt và ghi nhận kết quả. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Hoạt tính protease [12], [13], [36], [37]
Dựa vào khả năng phân giải protein của các chủng vsv bằng cách đo kích thước vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc.
Phương pháp
Cấy chấm điểm các chủng VK lactic trên MT8, nuôi trong tủ ấm 3 - 5 ngày. Dùng thuốc thử HgCl2 10% đổ lên bề mặt MT nuôi cấy. Nếu VK lactic sinh protease sẽ tạo thành vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc. Các vùng chưa phân huy sẽ có màu trắng đục do protein đã phản ứng tủa với HgCl2. Xác định hoạt tính protease bằng hiệu số(D - d, mm).
* Khả năng sinh khí từ glucose [12], [13], [36], [37]
Cấy 1% (v/v) dịch VK đã được hoạt hóa 24 giờ vào ống nghiệm chứa l0ml MT MRS dịch thể, bên trong đặt sẵn một ống durham chứa đầy MT MRS dịch thể. Các ống nghiệm được nút chặt bằng nút cao su. Sau 24 giờ nuôi cấy, nếu chủng có sinh khí, khí được tạo thành sẽ được bẫy lại thành bọt khí trong ống chuông durham, làm nổi ống chuông này. Quan sát khả năng sinh khí của chủng VK lactic nghiên cứu.
* Nhiệt độ phát triển [12], [13], [36], [37]
Mỗi nhóm vsv sẽ phát triển tốt ở nhiệt độ thích hợp và bị ức chê không phát triển ở nhiệt độ không thích hợp.
Phương phấp
Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 10 ml MT MRS dịch thể. Cấy 1% (v/v) dịch VK vào các ống nghiệm, nuôi ở các nhiệt độ 15°c, 25°c, 30°c, 35°c, 40°c, 45°c, 50°c trong 2 ngày. Riêng 15°c thì nuôi 7 ngày.
Quan sát sự sinh trưởng dựa vào khả năng làm đục MT ứng với mỗi nhiệt độ. * pH ban đầu [12], [13], [36], [37] Nguyên
tắc
Dựa vào khả năng sinh trưởng và phát triển tốt nhất của vsv trong điều kiện MT pH thích hợp.
Phương pháp
Chuẩn bị các ống nghiệm chứa l0ml MT MRS dịch thể. Điều chỉnh MT