1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.4.1.Phương pháp sàng lọc (Screening Test)
Các phương pháp ựược sử dụng ựể phát hiện sự hiện diện của một hoặc một nhóm chất ở một nồng ựộ quan tâm hay ựể phân biệt giữa các mẫu ựạt và không ựạt yêu cầu vệ sinh.Trong chiến lược phân tắch tồn dư, phương pháp sàng lọc thường ựược tiến hành trước khi ựịnh danh và ựịnh lượng chắnh xác.
Phương pháp sàng lọc hay ựược sử dụng nhất là phương pháp Receptor ựặc hiệu hoặc phương pháp bán ựịnh lượng miễn dịch enzyme hoặc miễn dịch phóng xạ. Test nhanh thường có khả năng nhận biết ựặc hiệu một hay một nhóm hormone nào ựó, chẳng hạn: Immuno Kit Kiểm tra Nhanh Hormone Beta Ờ Agonist của công ty Green Age, Beta-Agonist ELISA Test của hãng MaxSignal, Clenbuterol EIA hoặc Beta-Agonist EIA của hãng Euro Proxima
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 18
Immuno Kit Kiểm tra Nhanh Hormone Beta Ờ Agonist của công ty Green Age
Phương pháp miễn dịch enzym ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật miễn dịch enzyme ựể phát hiện kháng thể hay kháng nguyên dựa trên nguyên tắc miễn dịch học (Degand và Bernes-Duyckaerts, 1993). Nguyên lý của phương pháp là dựa vào phản ứng màu cạnh tranh của kháng nguyên cần xác ựịnh và và kháng nguyên có gắn enzym. Tất cả các giếng của khay cung cấp kèm theo kắt thường ựược phủ sẵn một lớp kháng thể cừu (kháng thể 1) có khả năng kết hợp với kháng kháng thể thỏ. Khi phân tắch, mẫu tách chiết và kháng nguyên có gắn enzym cùng ựược thêm vàọ Sau ựó kháng thể ựặc hiệu thỏ (kháng thể 2) ựược thêm vào sẽ diễn ra quá trình cạnh tranh giữa kháng nguyên có gắng enzym và kháng nguyên có trong mẫu (nếu có) với kháng thể ựặc hiệu thỏ. Trường hợp mẫu chứa dư lượng càng nhiều thì số kháng nguyên có gắn enzyme ựược gắn với kháng thể ựặc hiệu càng ắt. Khi cho chất tạo màu sẽ cho phản ứng màu càng ắt. Hay nói cách khác, màu sắc các giếng sau khi thêm chất tạo nền vào sẽ tỷ lệ nghịch với nồng ựộ kháng nguyên cần tìm có
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19 trong mẫụ Trong trường hợp này thường dùng máy ựọc ELISA có bước sóng 450 nm.
Ưu ựiểm của các phương pháp này là ựơn giản, dễ thực hiện, trang thiết bị thông thường, phổ phát hiện rộng, tương ựối nhạy (tùy vào chất cần phân tắch, bản chất mẫu), tương ựối nhanh, rẻ tiền. Tuy nhiên, phương pháp này vẫn có những nhược ựiểm, cụ thể:
Một số test ựọc kết quả bằng phân biệt màu sắc màu, do ựó nếu màu gần giống nhau thì rất khó phân biệt.
Các phương pháp sàng lọc hormone thường có ựộ ựặc hiệu cao, có thể sử dụng các loại mẫu khác nhau, có thể bán ựịnh lượng và cho kết quả nhanh. Tuy nhiên giá thành của các test này lại cao, có thể có phản ứng chéo dẫn ựến dương tắnh giả, hơn nữa còn ựòi hỏi kỹ thuật viên ựược ựào tạo với tay nghề và kinh nghiệm tốt mới ựảm bảo tắnh ổn ựịnh và chắnh xác của phép thử.
1.4.2. Phương pháp khẳng ựịnh và ựịnh lượng chắnh xác
Mục ựắch của phương pháp khẳng ựịnh là ựịnh lượng và ựịnh danh chắnh xác chất tồn dư. Với những chất cấm sử dụng, việc kiểm soát tồn dư có thể qua bước sàng lọc hoặc không qua bước sàng lọc mà sử dụng này phương pháp phân tắch khẳng ựịnh mà chủ yếu sử dụng các phương pháp lý hóa, gồm:
- Phương pháp sắc ký với nguyên tắc phân tách các hợp chất dựa vào sự bố trắ khác nhau giữ hai pha tĩnh và ựộng. Pha tĩnh (rắn hoặc lỏng) ở trong cột, pha ựộng ựi qua nhờ mao quản.
Có hai loại sắc ký là sắc ký khắ (GC Ờ Gas Chromatography) và sắc ký lỏng (LC Ờ Liquid Chromattography). Hiện nay, sắc ký khắ và sắc ký lỏng thường ựược gắn với ựầu ựọc khối phổ (LC-MS) và sắc ký khắ khối phổ (GC- MS). Ngoài ra còn có các dạng sắc ký khác như: Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC - Hight Performance Thin Layer Chromatography), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - Hight Performance Liquid Chromatography) và sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC Ờ Ultra Performance Liquid Chromatography).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20 Trên thực tế ựã có nhiều nghiên cứu ứng dụng Sắc ký lỏng khối phổ ựể phân tắch beta-agonist nói chung và clenbuterol trong thịt và trong thức ăn chăn nuôi nói riêng. Về cơ bản, phương pháp sắc ký lỏng khối phổ là sự kết nối HPLC với với ựầu dò có dòng ựiện ion hóa (mass spectrometry - MS) ba tứ cực. Hệ thống này ựược trang bị với bộ nguồn ion hoá phun ựiện tử (ESI) hoặc APCI, cho phép lựa chọn kỹ thuật Full Scan MS, SIM (Selected Ion Monitoring) và MRM (Multiple Reaction Monitoring). Trên cơ sở ựó lựa chọn kỹ thuật có ựộ chọn lọc (selectivity) và ựộ nhạy (sensitivity) cao ựể ựịnh tắnh và ựịnh lượng. Kỹ thuật phù hợp cả những chất có phân tử khối lớn hoặc nhỏ và có khả năng nhận hoặc mất nhiều proton. Chất phân tắch ựược tách trong hệ thống sắc ký lỏng, ựi qua một mao quản ựến ựầu dò MS. Tại ựây diễn ra quá trình ion hóa trong buồng API với kiểu ESI, APCI hoặc APPỊ Ion sinh ra ựược tập trung và gia tốc bằng hệ quang học ion ựể ựưa vào bộ phân tắch khốị Tại bộ phân tắch khối, tứ cực thứ nhất sẽ chọn ion mẹ có m/z xác ựịnh, các phân mảnh của ion này ựược tạo ra tại buồng va chạm (collision cell) nhờ tương tác với khắ trơ và ựược phân tắch nhờ tứ cực thứ ba, tạo ra tắn hiệu ựặc trưng tại bộ phận phát hiện ion. Như thế là sự ion hóa các phân tử hóa chất tạo nên khối phổ MS của chất ựó, tách và cô lập một loại ion nhất ựịnh. Sau ựó phân mảnh ion bị cô lập ựó rồi ựưa các mảnh ion ựó vào ựầu dò Detector ựể tạo ra khối phổ MS của loại ion ựã cô lập. đó là khối phổ full MSMS của chất ựó. Nếu lựa chọn một số ắt mảnh ion nhất ựịnh ựể ựưa vào ựầu dò, ta có phổ SRM hay MRM. Phương pháp có nhiều ưu ựiểm như ựộ chọn lọc cao, giới hạn phát hiện thấp, thời gian phân tắch nhanh, có thể ựịnh lượng ựồng thời các chất có thời gian lưu giống nhau mà phương pháp sắc kắ lỏng hiệu năng cao thường không làm ựược.
Các phương pháp lý hóa rất nhạy và nhận diện ựược rõ ràng, ựịnh lượng ựược chắnh xác chất tồn dư và rất nhạy nên ựược coi là phương pháp khẳng ựịnh. Tuy nhiên, phương pháp có một số nhược ựiểm như: ựòi hỏi quy trình phân tắch rất phức tạp (từ khâu chuẩn bị, tách chiết, làm sạch mẫu, ựến khâu vận hành máy), thiết bị rất ựắt tiền, yêu cầu kỹ thuật viên chuyên nghiệp và có tay nghề caọ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21
1.5. Các qui ựịnh liên quan ựến các chất kắch thắch sinh trưởng trong chăn nuôi
đối với các nước thuộc cộng ựồng chung Châu Âu, ựể kiểm soát dư lượng các chất, Ủy ban Châu Âu ựã ban hành quyết ựịnh số 377/90/EC nay ựược thay bằng Quyết ựịnh số 37/2010 quy ựịnh giới hạn cho phép thuốc thú y trong sản phẩm ựộng vật, theo ựó các sản phẩm có nguồn gốc từ ựộng vật phải ựược kiểm soát dư lượng tuân thủ Chỉ thị số 93/23/EC. đặc biệt các phương pháp phân tắch phải ựược công nhận hoặc thừa nhận theo quy ựịnh trong quyết ựịnh số 2002/657/EC. Trước sức ép ựó, muốn hàng hóa có nguồn gốc từ ựộng vật ựược phép lưu thông trên thị trường châu Âu, các nước xuất khẩu và các nhà sản xuất phải có chiến lược phân tắch kiểm soát dư lượng tốt và cần thiết phải có những nghiên cứu về hệ thống các phương pháp phân tắch sử dụng trong chương trình giám sát dư lượng.
Về phân tắch các chất kắch thắch sinh trưởng, phòng thắ nghiệm tham chiếu Quốc gia và cũng làm một trong những phòng thắ nghiệm tham chiếu của Châu Âu ở đức ựã áp dụng ựiều kiện phân tắch với yêu cầu hiệu năng phân tắch tối thiểu (MRPL: minimum required performance limit) của phương pháp sử cho các loại mẫu và các loại chất sinh trưởng khác nhau (bảng 1.2).
Bảng 1.3. Giới hạn tồn dư tối thiểu cho phép (MRPL) của phòng thắ nghiệm tham chiếu của đức
TT Loại mẫu Clenbuterol
(ppb) Salbutamol (ppb) Ractopamin (ppb) 1 Nước tiểu 0,2 1 1 2 Gan 0,2 5 1 3 Võng mạc 2 10 10 4 thịt 0,1 5 1 5 thận 0,5 5 1 6 Phân 0,5 5 1 7 Lông 5 10 10
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22 Tại Việt Nam, sau công bố của các phòng thắ nghiệm khu vực phắa nam thực hiện ựã gây ảnh hưởng rất lớn cho ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi lợn nói riêng vào năm 2010 và năm 2011 Bộ Nông nghiệp & PTNT ựã ban hành thông tư số 57/2012/TT-BNNPTNT (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2012) về việc giám sát chất cấm trong chăn nuôị Theo qui ựịnh của thông tư, khi phân tắch mẫu có thể sử dụng một trong hai cách sau:
ạ Cách thứ nhất (áp dụng trong trường hợp cần kết quả kiểm tra nhanh):
Tiến hành phân tắch ựịnh tắnh bằng kit thử nhanh hoặc phân tắch bán ựịnh lượng bằng kit ELISA chung cho nhóm Beta-agonist hoặc ựịnh tắnh riêng cho từng chất Clenbuterol, Salbutamol và Ractopaminẹ Giới hạn phát hiện (LOD) của kit thử nhanh và kit ELISA phải nhỏ hơn 0,2 ppb. Nếu kết quả âm tắnh thì kết thúc quá trình kiểm trạ
Nếu kết quả dương tắnh phải tiếp tục phân tắch ựịnh lượng bằng phương pháp sắc ký ựể khẳng ựịnh mẫu có thực sự dương tắnh với các chất cấm thuộc nhóm Beta-agonist hay không.
b) Cách thứ hai: dùng phương pháp phân tắch ựịnh lượng bằng phương
pháp sắc ký ựối với các chất Clenbuterol, Salbutamol và Ractopaminẹ
đặc biệt một ựiểm mới khác cần ghi nhận ở thông tư này ựã qui ựịnh việc xử lý kết quả rất cụ thể và ựảm bảo ựược sự chắnh xác về thông tin kết quả. Nếu kết quả âm tắnh bằng các phương pháp phân tắch trên thì khẳng ựịnh mẫu không vi phạm (hay mẫu âm tắnh với các chất cấm thuộc nhóm Beta-agonist). Kết quả dương tắnh bằng phân tắch ựịnh lượng là cơ sở ựể xử lý vi phạm và công bố mẫu vi phạm (hay mẫu dương tắnh với các chất cấm thuộc nhóm Beta-agonist). Căn cứ ựể khẳng ựịnh mẫu dương tắnh ựược quy ựịnh tại Phụ lục II ban hành kèm theo Thông tư nàỵ Mẫu ựược coi là dương tắnh khi có kết quả phân tắch ựịnh lượng cao hơn hoặc bằng một trong các giá trị (tắnh bằng ppb) nêu tại bảng 1.3.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23
Bảng 1.4. Quy ựịnh mẫu dương tắnh theo phương pháp ựịnh lượng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(Ban hành kèm theo Thông tư số 57/2012/TT-BNNPTNT ngày 07 tháng 11 năm 2012 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn)
Loại mẫu Clenbuterol Salbutamol Ractopamine
Thức ăn chăn nuôi 50,0 50,0 50,0
Thuốc thú y 50,0 50,0 50,0 Nước uống 5,0 5,0 5,0 Nước tiểu 2,0 2,0 2,0 Thịt 0,2 5,0 1,0 Thận 0,2 5,0 1,0 Gan 0,2 5,0 1,0 Máu 0,2 5,0 1,0
để ựáp ứng yêu cầu thực tế, Thông tư số 28/2014/TT-BNNPTNT ngày 04/9/2014 của Bộ Nông nghiệp và PTNT ựã ựược ban hành nhằm quản lý 22 loại hóa chất, kháng sinh cấm nhập khẩu, sản xuất, kinh doanh và sử dụng trong chăn nuôi gia súc, gia cầm tại Việt Nam. Danh mục này hợp nhất 02 Quyết ựịnh 54/2002/Qđ/BNN ngày 20/3/2002, Quyết ựịnh số 3762/Qđ-BNN ngày 28/11/2008 và bổ sung thêm 03 nhóm kháng sinh ựang quy ựịnh cấm sử dụng trong thú ỵ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24
2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. đối tượng, ựịa ựiểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1. đối tượng nghiên cứu
- Hộ kinh doanh thức ăn chăn nuôi và thuốc thú ỵ - Thức ăn chăn nuôi lợn và thịt lợn.
2.1.2. địa ựiểm nghiên cứu
- điều tra thực ựịa ựánh giá tình hình kinh doanh và quản lý chất lượng thức ăn chăn nuôi và thuốc thú y trên ựịa bàn ba tỉnh ựại diện của vùng đồng bằng sông Hồng gồm (Hưng Yên, Hải Dương và Thái Bình).
- Phòng thắ nghiệm Trung tâm khoa Chăn nuôi & Nuôi trồng thủy sản.
2.1.3. Thời gian nghiên cứu
đề tài ựược tiến hành từ tháng 9/2012 ựến tháng 10/2013
2.2. Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị
- Bộ kắt Clenbuterol ELISA Test Ờ 1021-01 (MaxSignalệ, do hãng BIOO SCIENTIFIC cung cấp). Theo tài liệu kèm theo kắt có khả năng phát hiện ở các mức nồng ựộ 0,025 ppb (ựối với thịt nếu áp dụng phương pháp tách chiết bằng dung môi hữu cơ) và 1 ppb (ựối với thức ăn chăn nuôi).
- Chất chuẩn Clenbuterol (hãng Dr. Ehrenstorfer) - Máy ựọc ELISA (hãng BIO-RAD);
- Các thiết bị dùng ựể tách chiết mẫu theo hướng dẫn của kắt.
- Mẫu trắng: là mẫu thức ăn và mẫu thịt lợn không chứa Clenbuterol. Mẫu trắng thức ăn chăn nuôi không chứa Clenbuterol là mẫu thức ăn chăn nuôi lợn thịt của công ty Cargill ựược khẳng ựịnh lại bằng phương pháp khẳng ựịnh. Mẫu trắng thịt lợn là mẫu ựược lấy từ lợn nuôi hoàn toàn bằng rau và cám gạo, cám ngô theo phương pháp truyền thống.
- Mẫu chứa thức ăn và mẫu thịt lợn chứa Clenbuterol ựã ựược khắng ựịnh bằng phương pháp Sắc ký lỏng khối phổ ựược cung cấp bởi Phòng thắ nghiệm
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25 phân tắch thực phẩm Khoa thú y, đại học Liege, Vương Quốc Bỉ, ựược coi làm mẫu dương tắnh thật.
* Chuẩn bị dung dịch chuẩn Clenbuterol
- Dung dịch chuẩn gốc 1mg/mL: Cân chắnh xác 10 mg chuẩn Clenbuterol, hòa tan và ựịnh mức tới 10 mL bằng Methanol (Dung dịch chuẩn ựược bảo quản trong tủ lạnh 3 tháng).
- Dung dịch chuẩn trung gian 1 ộg/mL ựược pha loãng 1000 lần từ dung dịch chuẩn bằng methanol (Dung dịch chuẩn ựược bảo quản trong tủ lạnh 1 tháng).
- Dung dịch chuẩn làm việc dùng ựể thêm vào mẫu ở nồng ựộ 100 ng/mL ựược chuẩn bị hàng ngàỵ
2.3 Nội dung nghiên cứu
2.3.1. Một số ựặc ựiểm về hoạt ựộng kinh doanh thức ăn chăn và thuốc thú y tại một số tỉnh vùng đồng bằng sông Hồng tại một số tỉnh vùng đồng bằng sông Hồng
- Hoạt ựộng kinh doanh thức ăn chăn nuôi - Hoạt ựộng kinh doanh thuốc thú y
- Quản lý nhà nước về thức ăn chăn nuôi và thuốc thú y (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.2. Nghiên cứu ựánh ựánh giá khả năng phân tắch phát hiện Clenbuterol trong thịt lợn và thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp ELISA trong thịt lợn và thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp ELISA
- Thăm dò tắnh ổn ựịnh thông qua thử nghiệm xây dựng ựường chuẩn - Xác ựịnh ngưỡng phát hiện của kắt ELISA ựối với từng loại nền mẫu - Xác ựịnh ựộ ựặc hiệu, ựộ chọn lọc và ựộ xác thực của phương pháp - Thử nghiệm phân tắch các mẫu dương tắnh thực bằng việc phân tắch các mẫu củng cố ở nồng ựộ khác nhau, mẫu thực ựã ựược khẳng ựịnh bằng phương pháp sắc ký.
2.4 Phương pháp nghiên cứu
để xác ựịnh nguồn gốc các chất cấm nói chung và hormone sinh trưởng nói riêng cũng như cách phân phối, sử dụng việc ựiều tra ựánh giá tình hình kinh
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26 doanh, phân phối thức ăn chăn nuôi và thuốc thú y là rất cần thiết. Kết quả bước ựầu sẽ là cơ sở cho việc xây dựng ựịnh hướng kiểm soát, ựịnh hướng lấy mẫu ựảm bảo ựộ chắnh xác và hiệu quả công tác thanh kiểm trạ
Mỗi tỉnh chọn ba huyện ựại diện ựược lựa chọn vừa có tắnh ựại diện về vị trắ ựịa lý (ựịa hình, khả năng kết nối trung tâm huyện hoặc trung tâm các huyện lân cận) vừa ựại diện cho mức ựộ phát triển chăn nuôi lợn của huyện thuộc ba tỉnh ựại diện (Hưng Yên, Hải Dương và Thái Bình). Các huyện ựược chọn gồm Phủ Cừ, Kim động, Văn Giang (ựối với Hưng Yên), Thành phố Hải Dương, Tứ Kỳ và Nam Sách (ựối với Hải Dương) và Thành phố Thái Bình, Quỳnh Phụ và Thái Thụy (ựối với Thái Bình).
Các thông tin thứ cấp thu thập từ số liệu Thống Kê Phòng Nông nghiệp, Trạm Thú Y các huyện, Sở nông nghiệp & PTNT và thông tin khảo sát thực tế là cơ sở ựể lựa chọn ựịa phương ựại diện của tỉnh.