4/ Thời gian và địa điểm nghiên cứu đề tài
2.4.2.1 Tạo nguồn giống Nấm men để phân lập và tuyển chọn
a. Tạo nguồn giống Nấm men
Chọn những trái Nho chín khơng bị hư hỏng. Cân 1ơg Nho và 6g đường nghiền chung cho nát rồi cho vào hũ thủy tinh, đậy nắp. Dưới chênh lệch áp suất thẩm thấu, dịch quả từ từ ngấm dần ra. Hệ Nấm men cĩ sẵn trong dịch quả sẽ sử dụng đường cĩ trong dịch quả và đường bổ sung để tăng trưởng và lên men cồn.
Sau 7 ngày lên men, lấy xác men lắng dưới đáy hũ chứa dịch lên men đem phân lập trên mơi trường Hansen vơ trùng.
b. Phương pháp phân lập Nấm men
Gieo cấy trên thạch đĩa: Dùng pipet hút và nhỏ 1 giọt dịch lên men vào giữa đĩa petri chứa mơi trường 2, sau đĩ dàn dịch trên đều khắp mặt thạch bằng que trang rồi úp ngược đĩa thạch. Mỗi mẫu ở một độ pha lỗng trãi đều trên 3 đĩa. Cấy xong thì bao gĩi các thạch đĩa và nuơi ở 28 – 300C trong 3 ngày. Cuối cùng, lấy ra quan sát các khuẩn lạc mọc trên các đĩa, chọn ra những khuẩn lạc cĩ đường kính lớn, trịn, lồi, trắng đục, bĩng, mọc riêng rẽ và phân biệt nhau cấy chuyền qua thạch nghiêng chứa mơi trường 1.
Kiểm tra tính thuần chủng:
Trong điều kiện vơ trùng, lấy một khuẩn lạc riêng lẻ đã phân lập được, hịa tan vào 10ml nước cất vơ trùng và lắc đều ta được dung dịch Nấm men cĩ đơ pha lỗng 10 lần. Nhỏ 1 giọt dịch vào đĩa petri chứa mơi trường 2, dùng que trang dàn đều ra. Sau đĩ, tiếp tục sử dụng que trang đĩ dàn lên thêm đĩa thạch thứ 2 và thứ 3 mà khơng lấy thêm giống.
Để các đĩa thạch này ở 28 – 300C, sau 3 ngày lấy ra quan sát các khuẩn lạc cĩ thuần khiết hay khơng bằng cách quan sát tiêu bản nhuộm bằng Fuchin dưới kính hiển vi. Nếu chúng đồng nhất về hình thái và khác nhau chút ít về kích thước thì chọn cấy vào thạch nghiêng để sử dụng. Nếu khơng, thì phải tiến hành làm lại từ đầu cho đến khi nhận được các đĩa thạch chứa khuẩn lạc thuần chủng.
c. Phương pháp cấy chuyền và giữ giống Nấm men
Dùng phương pháp cấy chuyền định kỳ lên mơi trường mới
Phân phối mơi trường cĩ chứa mơi trường 1 vào các ống nghiệm cĩ nút bơng. Tiến hành vơ trùng ở điều kiện 1210C trong vịng 15 phút. Đặt nghiêng ống thạch cho đến khi mơi trường đặc lại. Tiến hành dùng que cấy trịn, vơ khuẩn bằng đèn cồn, lấy một ít sinh
khối Nấm men cấy vào mơi trường thạch nghiêng mới. Tiến hành vơ khuẩn que cấy dưới ngọn đèn cồn và giữ các ống thạch nghiêng ở nhiệt độ phịng 3-5 ngày, sau đĩ giữ trong ngăn mát tủ lạnh (từ 10-200
C)