4/ Thời gian và địa điểm nghiên cứu đề tài
2.4.5.6 Phương pháp xác định tổng khả năng chống oxy hĩa [36]
Nguyên tắc
DPPH cĩ dạng tinh thể màu tím tan trong methanol cho dung dịch cĩ màu tím than. Về tính chất, DPPH là gốc tự do bền do cĩ hiệu ứng liên hợp trong phân tử và cĩ độ hấp thụ cực đại tại 517nm.
Mục đích
Cho các dịch chiết tác dụng với gốc tự do DPPH với cơ chế làm mất màu DPPH. Sau một khoảng thời gian nhất định, ta xác định được độ hấp thụ của hỗn hợp mẫu thử và độ hấp thụ của mẫu chứng ở bước sĩng 517nm. Từ đĩ, ta tính được khả năng đánh bắt gốc tự do của dịch chiết.
Cơ chế phản ứng của gốc tự do DPPH và chất chống oxi hĩa (A-H) DPPH + A-H DPPH-H + A
A + X A-X
Chuẩn bị mẫu
DPPH: pha thành dạng stock 1mg/ml, pha trong bình định mức 20ml. Cân 0,02g cho vào bình định mức 20ml, thêm methanol (Merck) vào đủ 20ml. Lắc đều cho tan hết. Bảo quản tránh ánh sáng, để ở 40
C.
Mẫu đối chiếu
Vitamin C: pha thành dạng stock 50mg/ml methanol trong trong eppendorf mới.
Tránh ánh sáng, bảo quản ở 40
C.
Các mẫu thử nghiệm đã được chiết từ dung mơi methanol sẽ được làm khơ trước bằng phương pháp cơ quay hoặc làm bay hơi ở 550
C.
Sau khi làm khơ, cân lại các mẫu chiết, hịa lại vào dung mơi tương ứng của từng mẫu sao cho cĩ nồng độ 100mg/ml. Từ đĩ, pha lỗng thành các nồng độ thấp hơn (0,25 – 4mg/ml) để phản ứng với DPPH và xác định giá trị EC50
Cách thực hiện
Cho 1ml DPPH 50µg/ml tác dụng với 4ml dịch chiết cĩ các nồng độ khác nhau (sao cho nồng độ cuối cùng trong dịch là 10µg/ml DPPH). Lắc đều, đem đo ở bước sĩng 517nm tại thời điểm 0, 30.
Trước mỗi thời điểm đo phải chứng mẫu: 1ml DPPH + 4ml dung mơi chiết. Vitamin C được sử dụng làm mẫu so sánh
Khả năng đánh bắt gốc tự do (S%) được tính theo cơng thức sau:
Ast: độ hấp thụ của mẫu thử ở thời điểm t = 30 phút. Act: độ hấp thụ của mẫu chứng ở thời điểm t = 30 phút.
Giá trị EC50 (mg dịch chiết khơ/ml): là giá trị nồng độ dịch chiết khơ tác dụng với gốc tự
do DPPH mà tại đĩ cĩ hoạt chất chống oxi hĩa là 50%. Giá trị EC50 càng thấp chứng tỏ khả năng chống oxi hĩa của dịch chiết từ mơi trường càng cao
Dựa vào kết quả hoạt tính chống oxi hĩa ở các nồng độ khác nhau của mẫu thử, ta xây dựng phương trình hồi quy sau:
Hoạt tính chống oxi hĩa (%) = a x nồng độ (mg/ml) + b
Dùng giá trị a và b trong phương trình hồi quy để tính giá trị EC50