NAC TFkiểm soát quá trình phiên mã của gen bằng cách liên kết với một trình tự nhất trí trong promoter của gen đích (Hình 1.7).
Hình 1.7. Sơ đồ nhân tố phiên mã NAC trong điều hòa phiên mã gen với stress phi sinh học [106]
Những nghiên cứu đầu tiên đã chỉ ra rằng một số protein NAC liên kết với đoạn 21bp trongpromoter 35S của virus khảm súp lơ (CaMV), hai trình tựtrung tâm CGTAvà CGTC trong đoạn đã được xác định [43]. Sau đó, vùng trình tự nhận biết của NAC TF (NAC recognition site - NACRS)CGT(G/A) và CACG được xem như các motif trung tâm của DB đã được xác định trong promoter của gen cảm ứng bởi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
hạnERD1(Early response to dehydration1)ởArabidopsis [113],những trình tự này được gọi chung là NACBS (NAC binding sites).
Nhân tố phiên mã NAC kích hoạt hoạt động của các gen chức năng mã hóa cho protein tham gia vào quá trình điều chỉnh thẩm thấu, loại bỏ các phản ứng oxy hóa và giải độc, bảo vệ các đại phân tử và ubiquitin. Nhóm thứ hai của các gen đích bao gồm protein điều hòa thực hiện chức năng trong việc truyền tín hiệu và điều khiển biểu hiện gen. Sự có mặt của NACRS trong promoter của một số gen làm cho chúng có khả năngđiều khiển trực tiếp các gen đích của NAC TF (ví dụ gen ERD1
và R2R3-MYB). Tầm quan trọng của NAC TF trong đáp ứng sinh lý ở thực vật dưới điều kiện bất lợi ngày càng được nhiều nghiên cứu chú ý và đánh giá cao [106].
1.2.2.4. Gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC ở một số cây trồng
Như đã biết, họ NAC là một trong những họ TF đặc trưnglớn nhất trong hệ genthực vật [106]. Nhiều nghiên cứu tập trung vào tạo dòng và phân lập các gen liên quan đến hạn hán trong họ NAC TF như: ANAC019, ANAC055, và ANAC072
từ Arabidopsis[113]. Kết quả tách chiết ANAC019từ mRNA của Arabidopsis thu được đoạn mã hóa dài 1232bp(Mã số: XM_002894363). Gen ANAC055được phân lập từ mRNA dài 1274bp (Mã số: NM_112418). ANAC072còn được biết đến với tên gọi RD26 (responsive to desiccation 26) được phân lập từ mRNA dài 1718bp (Mã số: NM_118875). Các gen này đã được kiểm tra và chứng minh có liên quan đến khả năng chịu hạn của Arabidopsis[113].Trong điều kiện hạn, sản phẩm biểu hiện của các gen ANAC019, ANAC055, và ANAC072 đều có thể gắn vào vùng promoter của gen ERD1 (early responsive to dehydration stress 1) và kết quả là tăng cường khả năng chịu hạn [114].
Nhiều thành viên trong họ gen NAC liên quan đến hạn hán đã được mô tả ởlúa. SNAC1 được cảm ứng bởi hạn hán, nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp, ABA trong lá và rễ [133]. SNAC1 tham gia vào khả năng chống chịu hạn và bảo vệ tế bào ở lúa, kết quả của sự biểu hiện này là làm tăng khả năng chống chịu hạn ở thời kì ra hoa trong tình trạng thiếu nước [54]. Quá trình biểu hiện của SNAC2/OsNAC6, OsNAC045, OsNAC063 đều làm tăng cường khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi trong đó có hạn hán ở lúa [55], [77], [133]. SNAC2 được kích hoạt chủ yếu trong
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
quá trình bảo vệ tế bào khỏi sự mất nước [55], được phân lập từ DNA hệ gen dài 1529bp mã hóa cho phân tử protein dài 303 amino acid (Mã số: HI422616).
Kết quả nghiên cứu ở cải bắp cho thấy, có 11 gen NAC đã được phân lập thành công. Chúng đều được biểu hiện dưới tác động của các yếu tố bất lợi từ môi trường. Gen ngắn nhất có chiều dài khoảng 733bp và dài nhất khoảng 1229bp [53].
Nhân tố phiên mã NAC ở lúa mì, TaNAC2, TaNAC4, TaNAC8 đã được tìm thấy trong phản ứng với hạn, lạnh, muối, bị thương tổn và ABA [123]. TaNAC2, TaNAC4 được phân lập từ DNA hệ gen có chiều dài 1566bp và 1515bp, trong đó có 3 exon và 2 intron, 3 exon mã hóa cho phân tử protein dài 405 và 396 amino acid (Mã số: HQ630372 và HQ630374). TaNAC8 được phân lập từ mRNA có chiều dài 1275bp (Mã số HM027573).
Ở đậu tương,nhiều protein NAC được xác định đã tham gia vào phản ứng với các stress phi sinh học trong đó có hạn hán như GmNAC2, GmNAC3 và GmNAC4
[87]. GmNAC3 vàGmNAC4 được cảm ứng biểu hiện bởi ABA, JA, mặn và hạn. Chúng đều được phân lập từ mRNA và có chiều dài khoảnghơn 1100bp.
Trên cây lạc, 3 gen thuộc họ NAC đã được phân lập thành công là AhNAC1, AhNAC2, AhNAC3 trong đó sự biểu hiện của AhNAC2, AhNAC3 cho thấy, các gen được cảm ứng bởi tình trạng thiếu nước, nồng độ muối cao và nhiệt độ thấp [71].
AhNAC2, AhNAC3 đều được tách chiết từ mRNA và có chiều dài 1565 và 1276bp (Mã số: EU755023 và EU755022). Gen AhNAC2 được chuyển thành công vào
Arabidopsis. Tăng cường khả năng chống chịu với hạn và muối đã được quan sát ở cây Arabidopsis chuyển gen qua phân tích Northernblot và RT-PCR [72].
Sau khi phân lập, những gen thuộc họ NAC được thiết kế với các promoter mạnh, đặc hiệu (CaMV35S promoter, rd29A promoter,…) và chuyển thành công vào một số loài thực vật nhờ kỹ thuật chuyển gen. Một số nghiên cứu công bố đã thu được cây trồng chuyển gen mã hóa NAC tăng cường khả năng chống chịu khi gặp tình trạng thiếu nước của môi trườngnhưArabidopsis, thuốc lá, lúa, lúa mỳ… [72],[77], [113], [127].
1.3. NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY TRỒNG BẰNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN THUẬT CHUYỂN GEN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
1.3.1. Cơ chế chuyển gen vào thực vật nhờ Agrobacterium tumefaciens
Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân thành hai nhóm phương thức chính: phương pháp chuyển gen gián tiếp và phương pháp chuyển gen trực tiếp. Trong phương pháp chuyển gen gián tiếp, gen được chuyển vào tế bào thực vật qua một sinh vật trung gian thường là virus hoặc vi khuẩn. Ở phương pháp chuyển gen trực tiếp, gen được chuyển trực tiếp vào tế bào thực vật thông qua những thiết bị hoặc thao tác nhất định mà không cần nhờ các sinh vật trung gian [1]. Tuy nhiên, tất cả các phương pháp chuyển gen trực tiếp đòi hỏi kỹ thuật cao, chính xác và rất tốn kém mà khả năng tái sinh sau chuyển gen lại thấp, vì thế, phương pháp chuyển gen gián tiếp sẽ mang lại hiệu quả cao hơn và kinh tế hơn. Trong các kỹ thuật chuyển gen gián tiếp thì chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens được sử dụng rộng rãi hơn cả bởi vì phương pháp này dễ sử dụng, ít tốn kém nhưng mang lại hiệu quả cao (lượng bản sao gen biến nạp ít – tạo thuận lợi cho việc phân tích cây chuyển gen và không gây tổn thương tế bào) [6].
Chủng A. tumefaciens và A. rhizogenes được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu chuyển gen ở thực vật. Theo cơ chế tự nhiên, hai loài này có khả năng xâm nhiễm qua vết thương của hầu hết các loài thực vật hai lá mầm và một số ít các loài thực vật một lá mầm, kết quả là gây ra những khối u hay hình thành lông tơ ở rễ. Về sau, người ta xác định được rằng trong tế bào của các dạng hoang dại A. tumefaciens
và A. rhisogenes có chứa một loại plasmid đặc biệt gọi là Ti-plasmid (Tumor- inducing plasmid) chứa một đoạn DNA (T-DNA (Transferred-DNA)) có thể chuyển sang tế bào chủ theo cơ chế tự nhiên. Do đó, Agrobacterium là một hệ thống chuyển gen tự nhiên [1],[4].
Bằng cách cải biến cắt bỏ những gen gây khối u và lông tơ ở rễ, cài xen vào vùng T-DNA (Transferred-DNA) những gen thích hợp, gen này sẽ được chuyển và gắn vào hệ gen tế bào thực vật dễ dàng. Những phát hiện này có ý nghĩa rất quan trọng cho sự ra đời của phương pháp chuyển gen vào thực vật nhờ vi khuẩn A. tumefaciens [134].
1.3.2. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm tăng cƣờng khả năng chịu hạn ở thực vật thực vật
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
1.3.2.1. Hệ thống tái sinh cây và quy trình chuyển gen a) Tái sinh cây ở thực vật a) Tái sinh cây ở thực vật
Hai giai đoạn biến nạp và tái sinh cây cùng có ý nghĩa quan trọng và quyết định đến thành công của một thí nghiệm chuyển gen. Nếu quá trình biến nạp xảy ra mà tế bào không tái sinh được thành cây hoặc sự tái sinh diễn ra mà không có sự biến nạp thì thí nghiệm chuyển gen chưa thành công [4].
Các yêu cầu cơ bản đối với hệ thống tái sinh cây
Các mẫu tế bào, mô dùng cho quá trình chuyển gen cần phải có khả năng tái sinh invitro nhanh. Các mô, tế bào này có khả năng tiếp nhận gen mới. Quy trình tái sinh cây phải có hiệu quả cao, không hoặc ít phụ thuộc vào kiểu gen. Cây tái sinh có tỷ lệ sống cao (khi đưa ra ngoài đất trồng), tần số biến dị thấp và khả năng hữu thụ cao để có thể sử dụng làm nguồn nguyên liệu ban đầu nhằm tiếp tục tiến hành các thí nghiệm ở các thế hệ tiếp theo.
Như vậy, có thể thấy hoàn thiện hệ thống tái sinh là điều kiện tiên quyết để thực hiện thành công quá trình biến nạp gen ở thực vật.Các loại mô được sử dụng trong hệ thống tái sinh như phôi non, phôi trưởng thành; Mô sẹo có nguồn gốc từ các bộ phận khác nhau ở cơ thể thực vật; Mô lá, thân mầm.
Tính toàn năng của tế bào thực vật đã tạo điều kiện cho sự tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro qua quá trình phát sinh cơ quan (hình thành chồi) hay phát sinh phôi khi chúng được nuôi cấy trong điều kiện dinh dưỡng thích hợp và bổ sung cácchất kích thích sinh trưởng cần thiết. Các chồi bất định hay phôi được hình thành từ các tế bào đơn được hoạt hóa là những bộ phận dễ dàng tiếp nhận sự biến nạp và có khả năng cho những cây biến nạp hoàn chỉnh (không có tính khảm).
Có thể thấy, tái sinh ở thực vật thông qua haicon đường:Phát sinh cơ quan (organogenesis) có thể xảy ra do sự phát triểnchồitrực tiếp từmẫu mô nuôi cấy [49] hoặc qua giai đoạn tạo mô sẹo còn gọi là sự phát sinh chồitừmôsẹo và con đường thứ hai là hình thành phôi soma(embryogenesis), thường cómộttế bào hoặcmộtcụm nhỏ các tếbàodiễn ra phản biệt hóa để tạo phôi soma (phôi vô tính) phát triển thànhcây hoàn chỉnh tương tự nhưphôi hữu tính (phôi zygotic) [35].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình thành phôi somalàmột giai đoạnquan trọng đối với quá trình tái sinh ở thực vật trong hệ thốngnuôi cấy tế bàoin vitro[85]. Phôi somalà kết quả của một quá trìnhphát triển từ các tế bàosomathành những cấu trúctương tựnhưphôi hữu tính thông qua các giai đoạn phát triển đặc trưnglàhình cầu, hình tim, hìnhngư lôi, mọc lá mầmvà trưởng thành [61]. Hệ thống tái sinh cây thông qua phôi somađược sử dụng phổ biến trong nuôi cấy in vitro do khả năng tái sinh cây khá cao và sự xuất hiệncủacây khảmcóthểđược giảm đángkể[35].
Phương thứctáisinhcây thông qua giai đoạn mô sẹo phụ thuộc vào nguồn gốc mô sẹo. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng mô sẹo dạng phôi có nguồn gốc từ đỉnh sinh trưởng có tỷ lệ tái sinh cây cao hơn [61]. Ngoài ra khả năng tái sinh cây cũng chịu ảnh hưởng lớn bởi thành phần và nồng độ các chất kích thích sinh trưởng thực vật được bổ sung vào môi trường nuôi cấy.
Phần lớn thực vật được tái sinh dễ dàng bằng con đường nuôi cấy mô tế bào. Từ một tế bào biến nạp có thể tạo ra một cây chuyển gen, trong đó mỗi tế bào mang DNA ngoại lai và tiếp tục chuyển cho thế hệ sau sau khi nở hoa và tạo hạt.