KẾTQUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.3. Phân nhóm các giốnglạc theo khả năngchịu hạn
Nhằm khảo sát mối liên quan giữa khả năng chịu hạn của các giống lạc nghiên cứu với các chỉ tiêu đánh giá ở mức độ mô sẹo và cây non (Khả năng chịu mất nước của mô sẹo, tỷ lệ sống sót của mô sẹo, chỉ số chịu hạn tương đối, hàm lượng proline), chúng tôi sử dụng phần mềm NTSYS pc để phân tích các chỉ tiêu này, kết quả được thể hiện ở hình 3.2.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.2. Biểu đồ hình cây của 10 giống lạc dựa trên các chỉ tiêu đành giá ở mức độ mô sẹo và cây non(T – chịu hạn tốt, K – chịu hạn khá, Y – chịu hạn kém)
Theo biểu đồ có thể chia 10 giống lạc nghiên cứu thành 3 nhóm: Nhóm chịu hạn tốt gồm 2 giống: L12, L16
Nhóm chịu hạn khá gồm 4 giống: L20, MD7, L14, Sen lai Nhóm chịu hạn yếu gồm 4 giống: L08, L15, LVT, TB25
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.3. Một số hình ảnh trong xử lý hạn ở giai đoạn mô sẹo và cây non A. Mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy; B. Cả khối mô sẹo sau xử lý thổi khô trên môi trường phục hồi; C. 1/2 khối mô sẹo sau xử lý thổi khô trên môi trường phục hồi; D. 1/4 khối mô sẹo sau xử lý thổi khô trên môi trường phục hồi; E. 1/8 khối mô sẹo sau xử lý thổi khô trên môi trường phục hồi; F. Cây lạc trước khi xử lý hạn; G. Cây lạc sau khi xử lý hạn nhân tạo 5 ngày; H. Cây lạc sau khi xử lý hạn nhân tạo 5 ngày.
A B
C D
E F
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Về tác động của hạn đến thực vật, nhiều nghiên cứu đã tiến hành khảo sát tính chịu hạn của các đối tượng thực vật trong điều kiện tự nhiên ngoài đồng ruộng hoặc trong điều kiện nhân tạo tại phòng thí nghiệm. Nhiều cây trồng như ngô, lúa, đậu tương, lạc…đã được các nhà nghiên cứu đánh giá, khảo sát về đặc tính chịu hạn thông qua các điều kiện tự nhiên ngoài đồng ruộng[5], [10], [15]. Phương pháp được sử dụng là chủ động gây ra sự thiếu nước và tiến hành nghiên cứu phản ứng của các cơ thể thực vật trong điều kiện này. Trên thế giới và Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu nhằm đánh giá tác động của hạn và nâng cao tính chịu hạn ở cây trồng ở mức độ in vitro như ở lạc [14], khoai tây [67],… Khi chọn lọc tế bào chịu hạn, có thể tiến hành xử lý bằng cách trực tiếp thổi khô hoặc sử dụng các chất gây áp suất thẩm thấu cao như PEG (polyethylene glycol), manitol, sorbitol, saccharose…Các kết quả nghiên cứu ở điều kiện tự nhiên hoặc trong phòng thí nghiệm đã góp phần giải thích một phần cơ chế chịu hạn ở thực vật.
Những kết quả ban đầu về khả năng chịu hạn của các giống lạc nghiên cứu ở giai đoạn mô sẹo và cây non sẽ là cơ sở để tiến hành những nghiên cứu tiếp theo trên các giống lạc có khả năng phản ứng khác nhau trong tình trạng thiếu nước. Bên cạnh việc phản ứng về mặt hình thái và hóa sinh nhằm đối phó với tình trạng thiếu nước, một cơ chế vô cùng quan trọng được kích hoạt nhằm đảm bảo hoạt động của tế bào và cơ thể thực vật là cơ chế phân tử của đặc tính chịu hạn. Đó là các gen trực tiếp hoặc các gen liên quan đến quá trình điều hòa biểu hiện gen với các yếu tố bất lợi từ ngoại cảnh.
3.2. KẾT QUẢ TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN NAC2
Mục đích của việc phân lập gen là thu được phân tử DNA mã hóa cho protein mang tính trạng quan tâm và có thể sử dụng được vào việc chuyển gen để cải tạo giống cây trồng. Một trong những phương pháp phân lập gen được sử dụng phổ biến hiện nay là phân lập gen thông qua nhân bản DNA bằng PCR.
Nhân tố phiên mã NAC tồn tại khác nhau trong cây là nhóm nhân tố điều hòa phiên mã với nhiều chức năng sinh học. Không chỉ có chức năng quan trọng khác nhau trong quá trình phát triển của thực vật mà còn đáp ứng được trong việc chống chịu với các điều kiện bất lợi từ ngoại cảnh trong đó có hạn hán. Chúng tôi lựa chọn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
giống lạc chịu hạn tốt L12 làm nguồn mẫu vật cho quá trình nhân bản gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2.
3.2.1. Nhân bản gen NAC2
Dựa trên trình tự gen AhNAC2 của cây lạc đã công bố tại Ngân hàng Gen quốc tế (EU755023), cặp mồi đặc hiệu NAC2NcoI/NAC2NotIđược thiết kế để nhân gen
NAC2.
Hạt lạc giống L12 được trồng vào các chậu với chế độ chăm sóc và tưới nước như nhau trong điều kiện nhà lưới. Sau khi cây sinh trưởng, phát triển khoảng 5 tuần ngừng tưới nước nhằm tạo hạn. Sau một tuần gây hạn tiến hành thu mẫu lá phục vụ thí nghiệm. Từ lá của giống lạc L12 đã qua xử lý hạn, RNA tổng số được tách chiết và tổng hợp cDNA. Gen NAC2 được nhân lên bằng kỹ thuật PCR và kiểm tra bằng điện di trên gel agarose. Kết quả nhân dòng trên hình 3.4 cho thấy, đoạn gen thu được có kích thước tương ứng với kích thước tính toán theo lý thuyết (trên 1kb).
Hình 3.4.Kết quả điện di sản phẩm nhân gen NAC2 từ giống lạc L12 M: Thang DNA chuẩn 1 kb.
3.2.2. Tách dòng gen NAC2
Quá trình tách dòng được thực hiện bằng cách gắn sản phẩm PCR đã tinh sạ
E. coli
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - E. coli - . . NAC2 qua - - đặc hiệuNAC2NcoI/NAC2NotI. -
gel agarose. ẩ NAC2
hơn 1kb (hình 3.5).