KẾTQUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3.1. Thiết kế vector tái tổ hợp chứa cấu trúc mang gen mã hóanhân tố phiên mã NAC
thiện tính chịu hạn của cây lạc.
3.3. THIẾT KẾ VECTOR CHỨACẤU TRÚC MANG GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ NAC2 VÀ CHUYỂN VÀO CÂY THUỐC LÁ TỐ PHIÊN MÃ NAC2 VÀ CHUYỂN VÀO CÂY THUỐC LÁ
Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong việc nghiên cứu các nhân tố phiên mã NAC để chuyển vào cây trồng đã được nhiều tác giả đề cập đến trên các đối tượng thực vật khác nhau (Arabidopsis, đậu tương, lạc, lúa…) [72], [74], [87], [133].
Bước đầu đã có những thành công nhất định trong việc giải thích cơ chế liên quan của nhóm nhân tố phiên mã này đến khả năng chống chịu hạn của cây trồng.
Trong nội dung nghiên cứu, chúng tôi trình bày kết quả thiết kế thành công vector mang cấu trúc gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 nhằm điều khiển tính chống chịu hạn và những kết quả đầu tiên thu được trong việc chuyển vector mang cấu trúc chịu hạnvào cây thuốc lá. Kết quả thu được sẽ là tiền đề cho việc chuyển cấu trúc này vào cây lạc nhằm tạo ra các giống lạc có khả năng chịu hạn tốt phục vụ cho công tác chọn giống.
3.3.1. Thiết kế vector tái tổ hợp chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 mã NAC2
Dựa trêntrìnhtự gen AhNAC2đã công bố trên ngân hàng gen (No.
EU755023) [71], tiến hành thiết kế 2 cặp mồi nhân gen NAC2 ở giống lạc chịu hạn tốt L12 mang điểm cắt của các enzyme NcoI/NotI và XbaI/SacI. Điểm cắt của
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
NcoI/NotI được sử dụng trên vector pRTRA7/3, điểm cắt của XbaI/SacI sử dụng trên vector pBI121.
Vector pRTRA7/3 được sử dụng trong nghiên cứu của chúng tôi do có chứa 2 đoạn trình tự quan tâm là c-myc, KDEL. Hai trình tự này sẽ được ghép nối vào gen NAC2 nhằm nghiên cứu mức độ biểu hiện của gen sau khi chuyển thành công cấu trúc vào thực vật.
Gen NAC2 được nhân lên bằng cập mồi đặc hiệu NAC2NcoI/NAC2NotI, sản phẩm PCR điện di có kích thước khoảng hơn 1kb (Hình 3.4).
Tạo vector tái tổ hợp pRTRA7/3:NAC2
Vector pRTRA7/3có kích thước khoảng 4,2kb. Đoạn trình tự cần loại bỏ nằmtrong giới hạn cắt của enzyme NcoI/NotI có kích thước khoảng 1,7kb. Vì vậy sau phản ứng cắt đoạn vector chúng tôi sử dụng cho phản ứng ghép nối có kích thướctương ứng khoảng 3,5kb.
Sản phẩm PCR được tinh sạch và xử lý cắt enzyme NcoI/NotIcùng với vector pRTRA7/3.Vector pRTRA7/3 có chứa các gen mã hóa peptide chức năng như sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bước 1: Loại bỏ đoạn trình tự LeB4SP/anti-ABA scFv; Bước 2: Ghép nối đoạn gen NAC2 vào vector pRTRA7/3; Bước 3: Thiết kế cặp mồi NAC2XbaI/NAC2SacI để
tách dòng gen NAC2/c-myc/KDEL từ vector pRTRA7/3:NAC2.
Sau phản ứng ghép nối, vector tái tổ hợp pRTRA7/3:NAC2 được kiểm tra bằng
phản ứ - NAC2NcoI/NAC2NotI và bằng phản
ứng cắt bởi enzyme NcoI/NotI.
Hình ảnh điện di sản phẩm cắt trên hình 3.12 - A cho thấy, kết quả thu được hai phân đoạn gen có kích thước khoảng 1,1kb và 3,5kb, tương ứng với kích thước của gen NAC2 (nối thêm đoạn c-myc và KDEL) và vector pRTRA7/3. Đồng thời
thực hiện phản ứ - NAC2NcoI/NAC2NotI, kết
quả trên hình 3.12 - B cho thấy, sản phẩm thu được phân đoạn gen có kích thước tương ứng với tính toán theo lý thuyết (1,1kb).
Hình 3.12. Kết quả điện di trên gel agarose 1% (từ vector pTRA7/3:NAC2)
A. Kết quả điện di sản phẩ pRTRA7/3:NAC2 (NotI/NcoI);
B.Kết quả điện di sản phẩ -
NAC2NcoI/NAC2NotI từ vector pTRA7/3:NAC2.
Tạo vector tái tổ hợp pBI121:NAC2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Vector pBI121 được sử dụng để chuyển vào tế bào thực vật thông qua A. tumefaciens.
Hình 3.13. Vector pBI121
Vector pBI121 là vector mang promoter 35S điều khiển đoạn peptide mã hóa cho β-glucuronidase với hai đầu bị cắt bởi hai enzyme giới hạn XbaI/SacI. Để thực hiện quá trình ghép nối đoạn gen NAC2/c-myc/KDEL từ vector pRTRA7/3 vào vector pBI121 chúng tôi sử dụng cặp mồi NAC2XbaI/NAC2SacIđể nhân đoạn gen
NAC2/c-myc/KDEL từ vector pRTRA7/3. Kết quả nhân gen được thể hiện trong hình 3.14 – A.
Phản ứng cắt đồng thời đoạn gen NAC2/c-myc/KDEL và vector pBI121 được tiến hành với enzyme XbaI/SacI. Sản phẩm cắt được thôi gel, tinh sạch để tiến hànhphản ứng ghép nối tạo vector tái tổ hợp pBI121:NAC2 (Hình 3.14 - B).
3.14.Kết quả điện di trên gel agarose 1% (colony - PCR từ vector
pRTRA7/3:NAC2và kết quả thôi gelpBI121 và NAC2)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
A. Kết quả đ -
NAC2XbaI/NAC2SacI từ vector pRTRA7/3:NAC2; B. Kết quả thôi gel vector
pBI121 và NAC2 XbaI/SacI.
Vector pBI121có kích thước khoảng 13kb, trong đó gen mã hóa cho β-
glucuronidase dài khoảng 1,8kb. Như vậy khi xử lý cắt bằng enzyme XbaI/SacI sẽ thu được 2 phân doạn có kích thước khoảng 1,8kb và 11,2kb tương ứng với kích thước của gen GUS và vector pBI121. Đoạn vector 11,2kb sẽ được sử dụng để tiến hành phản ứng ghép nối với đoạn gen NAC2/c-myc/KDEL.
Sau phản ứng ghép nối, kiểm tra vector tái tổ hợp bằng phản ứ -
NAC2XbaI/NAC2SacI cho thấy sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho băng có kích thước khoảng 1,1kb (Hình 3.15 - A). Sản phẩm cắt vector bằng XbaI/SacI thu được 2 phân đoạn gen khoảng 1,1 và 11,2kb phù hợp với kích thước tính toán theo lý thuyết của gen NAC2 và vector pBI121 (Hình 3.15 - B). Như vậy cấu trúc gen NAC2 đã được thiết kế thành công vào vector pBI121 sử dụng trong chuyển gen ở thực vật.