T H3 ngày hạn 5 ngày hạn 7 ngày hạn 9 ngày hạn
3.4.2. Chuyển gen chỉ thị GUS thông qua vi khuẩn A.tumefaciens
Hiện nay có rất nhiều vector chuyển gen vào thực vật thông dụng được thiết kế có mang gen GUSnhư pBI121, pCAM301… Hiệu suất của quá trình chuyển gen không chỉ phụ thuộc vào hệ thống tái sinh mà còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, trong đó có đặc điểm di truyền của giống. Một số nghiên cứu chuyển gen thành công vào cây lạc thông qua mô sẹo phôi đã được công bố, chúng tôi lựa chọn giống lạc LVT để tiến hành thí nghiệm chuyển gen chỉ thị GUS.
A B
CA A
C D
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Tuy nhiên để xác định LVT có phải là giống thích hợp cho việc chuyển gen theo phương pháp này hay không, chúng tôi đã khảo sát khả năng chuyển gen thông qua việc sử dụng gen chỉ thị GUS vào mô sẹo hình thành từ phôi trục hạt lạc.
Phôi trục sau 10 ngày nuôi cấy đã phát triển thành khối mô sẹo. Chia tách mô sẹo và lây nhiễm trong dịch huyền phù vi khuẩn mang gen GUS20 phút. Đặt mẫu đã lây nhiễm trên mặt môi trường CCM, đồng nuôi cấy 5 ngày trong tối ở 250C.
Rửa nhanh mẫu trong môi trường SIM lỏng có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn cefotaxim, sau đó thấm khô, đặt mẫu lên môi trường tạo phôi soma trong 7 tuần. Chuyển phôi soma sang môi trường tái sinh cây SIM1. Sau 2 tuần, chuyển các mẫu tạo chồi lên môi trường tạo chồi SIM2 chứa kháng sinh chọn lọc trong 2 tuần để tăng hiệu quả chọn lọc.
Bảng 3.14. Kết quả chuyển gen GUSqua mô sẹo và phôi soma hạt lạc bằngA. tumefaciens
Giống Tổng số mẫu thí
nghiệm
Số chồi sống sót trên môi trƣờng chọn lọc
Số cây ra rễ trên môi trƣờng chọn lọc
LVT 919 146 51
Sau khi đồng nuôi cấy, tạo phôi soma, các chồi sẽ bị sàng lọc trên môi trường cảm ứng tạo đa chồi chứa kháng sinh kanamycine (SIM1, SIM2). Kết quả thu được các chồi phát triển trên môi trường SIM chứa kháng sinh chọn lọc, cây lạc hoàn chỉnh trên môi trường ra rễ đã được tạo thành công.
Tiến hành nhuộm hóa tế bào để khẳng định sự có mặt của sản phẩm GUS
thông qua hoạt động biểu hiện của gen GUS. Nhuộm GUS được thực hiện trong thí nghiệm xác định biểu hiện ở giai đoạn phôi soma và cây chuyển gen hoàn chỉnh.
Sản phẩm sơ cấp 5-Br-4Cl-3indolyl vẫn còn là một chất dễ tan và không màu.Nhưng ngay sau đó sản phẩm này bị oxy hóa và dimer hóa thành một phức hệ không tan có màu xanh. Các mẫu thí nghiệm chuyển gen GUSsẽ cho màu xanh chàm từ cơ chất không màu X-gluc.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.23. Biểu hiện gen GUS ở phôi soma và cây lạc chuyển gen
A. Biểu hiện gen GUS trên phôi soma chuyển gen; B. Biểu hiện gen GUS trên phôi soma không chuyển gen;C. Biểu hiện gen GUS trên cây lạc chuyển gen; D. Biểu
hiện gen GUS trên cây lạc không chuyển gen.
Các mẫu phôi soma sau 7 tuần nuôi cấy được kiểm tra biểu hiện gen GUS
tạm thời bằng phương pháp nhuộm màu với cơ chất X-Gluc (Hình 3.23 - A). Sau 4 tuần trên môi trường tạo đa chồi SIM1 không chứa chất chọn lọc, các cụm chồi được chuyển sang môi trường SIM2 chứa BAP với nồng độ 2mg/l. Trên môi trường này, đa số các cụm chồi bị hóa vàng, khô và chết dần. Tỷ lệ mẫu sống sót sau 2 tuần trên môi trường chứa chất chọn lọc thống kê được là 146 chồi. Những cụm chồi sống sót sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ và tiếp tục chọn lọc. Cây lạc hoàn chỉnh đã được nhuộm màu với cơ chất X-Gluc. Biểu hiện gen GUStrên cây lạc chuyển gen được mô tả trên hình 3.23 – B.
A B
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.24. Sơ đồ hoàn chỉnh quy trình chuyển gen ở cây lạc qua mô sẹo và phôi soma
Như vậy, dựa trên tỷ lệ mẫu phôi soma biểu hiện gen GUS tạm thời, cũng như tỷ lệ mẫu sống trên môi trường chọn lọc, biểu hiện gen GUS trên cây lạc chuyển gen, chúng tôi nhận thấy, LVT là giống lạc thích hợp với phương pháp chuyển gen qua mô sẹo và phôi soma.
Từ các kết quả trên, chúng tôi trình bày quy trình hoàn chỉnh cho việc tái sinh phục vụ chuyển gen đối với cây lạc qua mô sẹo và phôi soma trên hình 3.24.