KẾTQUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3.2. Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen mã hóanhân tố phiên mã NAC
Biến nạp vector pBI121:NAC2 vào tế bào vi khuẩn A.tumefaciens chủng CV58
bằng xung điện
Để kiểm tra hoạt động của cấu trúc đã thiết kế trong cây trồng cũng như tạo nguyên liệu chuẩn bị cho quá trình chuyển gen tạo cây trồng chịu hạn, cấu trúc
pBI121:NAC2 được biến nạp vào vi khuẩn A.tumefaciens chủng CV58bằng phương pháp xung điện. Sản phẩm sau khi biến nạp được nuôi trên môi trường chọn lọc chứa kháng sinh thích hợp, lựa chọn các dòng khuẩn lạc trắng để kiểm tra. Chúng tôi chọn ngẫu nhiên 8 dòng khuẩn lạc đem nuôi lỏng và tiến hành tách chiết plasmid, thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu NAC2XbaI/NAC2SacI. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel được thể hiện trên hình 3.17 cho thấy cả 8 dòng khuẩn lạc đều cho kết quả dương tính với kích thước đúng như tính toán (khoảng 1,1kb). Điều này chứng tỏ đã biến nạp vector pBI121:NAC2vào tế bào
A.tumefaciens chủng CV58 thành công và đạt hiệu quả cao.
3.17. Sản phả -
NAC2-XbaI/NAC2-SacI 8 dòng plasmid tách từ Agrobacterium
Như vậy, chúng tôi đã tạo được chủng A.tumefaciens CV58 mang plasmid tái tổ hợp pBI121:NAC2. Đây là nguồn nguyên liệu phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen nhằm tạo cây trồng với mong muốn cải thiện được đặc tính chịu hạn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chuyển cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn A.tumefaciens CV58
Để kiểm tra hoạt động của cấu trúc pBI121:NAC2 trong cây, bước đầu chúng tôi thử nghiệm chuyển cấu trúc vào thuốc lá, một trong những cây mô hình phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen ở thực vật.
Cấu trúc pBI121:NAC2mang promoter 35Sđiều khiển hoạt động của gen
NAC2 được chuyển vào mảnh lá cây thuốc lá giống C91. Các dòng cây chuyển gen
đượ chọn lọc ồng độ 50
mg/l. Chỉ những cây thuốc lá mang gen chuyển mới có thể sống sót trên môi trường chọn lọc. 194 dòng cây được chúng tôi đưa ra trồng ngoài điều kiện tự nhiên.
Bảng 3.9. Kết quả chuyển cấu trúc mang gen NAC2vào cây thuốc lá
Lô thí nghiệm Số mẫu biến nạp Số mẫu tạo chồi
Số chồi trên môi trƣờng ra rễ Số cây ra giá thể 1 50 48 86 67 2 50 45 82 62 3 50 47 80 65 Tổng 150 140 248 194 A B C D E F
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.18. Hình ảnh chuyển cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2
vào cây thuốc lá
A. Mảnh lá trên môi trường GM; B. Mảnh lá ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn; C. Mảnh lá trên môi trường cộng sinh; D. Mảnh lá trên môi trường GM + KS; E. Cụm chồi trên môi trường GM + KS; F. Cây con trên môi trường RM + KS; G.Ra
cây trong bầu đất:trấu:cát; H. Cây trong bầu đất; I. Ra nhà lưới.
Hình 3.19. Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng thuốc lá chuyển gen M: marker 1kb; 1-9: Các dòng chuyển gen; (-) Đối chứng âm; (+) Đối chứng dương
Các dòng thuốc lá sau một khoảng thời gian nhất định sống sót ngoài tự nhiên đã được chúng tôi kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu
NAC2XbaI/NAC2SacI. Kết quả ở hình 3.18 cho thấy, trong số 9 dòng thuốc lá sàng lọc ngẫu nhiên sau kiểm tra đều cho phản ứng dương tính, các giếng điện di xuất hiện băng DNA đặc hiệu có kích thước khoảng 1,1kb.
Các dòng cây thuốc lá chuyển gen cho kết quả dương tính ban đầu với phản ứng PCR được trồng và tiếp tục theo dõi nhằm có những phân tích tiếp theo về khả năng biểu hiện của gen chuyển.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/