c. Tách chiết plasmid tái tổ hợp
2.2.3.7. Thiết kế cấu trúc mang gen mã hóanhân tố phiên mã NAC
Quá trình thí nghiệm để tiến hành thiết kế cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2được mô tả theo các bước như sau:
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt NAC2và vector pTRA7/3 bằng NotI và NcoI
STT Thành phần Thể tích 1 Buffer O (1X) 2 μl 2 NAC2 (pTRA7/3)(10 – 20 ng/µl) 3 (10) μl 3 Enzyme NotI 0,2 μl 4 Enzyme NcoI 0,4 μl 5 H2O khử ion 14,4 (7,4) μl Tổng thể tích 20 μl
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ STT Thành phần Thể tích 1 NAC2(10 – 20 ng/µl) 7,5 l 2 pTRA7/3(10 – 20 ng/µl) 5 l 3 Buffer T4 ligase (1X) 2 l 4 T4 ligase 1 l 5 H2O khử ion 4,5 l Tổng thế tích 20 l
Hỗn hợp phản ứng được ủ ở nhiệt độ 220C trong 2 giờ. Đặt phản ứng trên đá và thực hiện quá trình biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5 .
Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc chịu hạn pBI121:NAC2
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng cắt NAC2 và vector pBI121 bằng XbaI, SacI
STT Thành phần Thể tích
1 Buffer Tango(1X) 2 μl
2 NAC2 (pBI121)(10 – 20 ng/µl) 10 μl
3 Enzyme XbaI, SacI 1 μl
4 H2O khử ion 6 μl Tổng thể tích 20 μl Bảng 2.9. Thành phần phản ứng ghép nối pBI121:NAC2 STT Thành phần Thể tích 1 NAC2 (10 – 20 ng/µl) 8 l 2 pBI 121 (10 – 20 ng/µl) 4 l 3 T4 buffer (1X) 2 l 4 T4 ligase 1 l 5 H2O khử ion 5 l Tổng thế tích 20 l
Hỗn hợp phản ứng được ủ ở nhiệt độ 220C trong 2 giờ. Đặt phản ứng trên đá và thực hiện quá trình biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5 .
+ Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
+ Tách chiết plasmid theo bộ kit Plasmid Extraction Kit (Bioneer).
Quá trình thiết kế vector được mô tả tóm tắt theo sơ đồ dưới đây:
Biến nạ (vector chuyển gen mang cấu trúc chịu hạn
NAC2:pBI121) vào tế .
Rửa cuvette xung điện bằng cồn 100oC, rửa lại bằng nước khử ion, khử trùng 1) Tế bào khả biến đặt trong đá 5 phút, bổ
tế bào khả biến và trộn nhẹ.
2) Chuyển tất cả hỗn hợp dịch A. tumefaciens .
Xung điện: 2,5kv, 25µF và điện trở 400, đặt vào đá. Sau 5 phút bổ sung 500 l LB lỏng và trộn nhẹ. RE PCR pTRA7/3 KDEL CaMV35S c-myc Ligation pTRA7/3:NAC2 NAC2 THIẾT KẾ MỒI cDNA NAC2
NAC2 c-myc KDEL Ligation pBI121
35S prom Β-gluc TER
pBI121:NAC2
35S prom
NAC2 c-myc KDEL TER
CaMV35S
c-myc
KDEL
Hình 2.2. Sơ đồ tạo vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3) Chuyển sang ống eppendorft 2ml, ủ ở 28oC trong 1 giờ trên máy lắc. 4) Chuyển 300µl vào các đĩa chọn lọc chứa kháng sinh kanamycine 40 mg/l và rifamycin 50mg/l. Ủ ở 28oC từ 24 - 48 giờ.
5) Kiểm tra bằng phản ứng colony-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu..
Bảng 2.10. Thành phần của phản ứng cắt plasmid pBI121:NAC2
STT Thành phần Thể tích 1 Buffer Tango (1X) 1 l 2 Enzyme XbaI 0,2 l 3 Enzyme SacI 0,2 l 4 Plasmid 5 l 5 Nước khử ion 3,6 l Tổng thể tích 10 l 2.2.3.8. Phƣơng pháp xác định trình tự DNA
Xác định trình tự gen trên máy phân tích trình tự tự động theo phương pháp của Sanger.
Trình tự gen được xử lý bằng phần mềm Clustal W.
chuyển gen
Phân tích biểu hiện gen GUS bằng nhuộm hóa mô tế bào
GUS Jefferson vàđtg
(1987) [58]. Mẫu phôi soma hoặc cây tái sinh hoàn chỉnh được ngâm trong dung dịch X-gluc (50mM Na2HPO4 và NaH2PO4; pH = 7,0; 10 mM K3[Fe(CN)6]; 10 mM K4[Fe(CN)6]; 10mM Na2EDTA; 0,1% Triton-100; 1,5 mM X-glucuronide) và ủ trong tủ ổn nhiệt ở nhiệt độ 370C, thời gian ủ từ 24-48h. Sau thời gian ủ, mẫu được rửa sạch bằng nước cất khử trùng và ngâm vào dung dịch cồn 70% nhằm loại bỏ diệp lục. Sau khi loại bỏ diệp lục, mẫu được đưa lên kính lúp soi nổi, quan sát chụp ảnh. Những vùng có gen GUS nhuộm màu xanh lam.
ợ ốc lá chuyển gen
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
vớiphản ứng PCR, tiến hành thí nghiệm gây hạn nhân tạo bằng cách ngừngtưới
nước ở các giai đoạn khác nhau. Xác định h ợ ốc
lá chuyển gentheo mô tả trong mục 2.2.1.3.
Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng phản ứng PCR
Mẫu lá cây chuyển gen được thu và tách chiết DNA tổng số. Gen NAC2 được phân lập bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu NAC2XbaI/NAC2SacItheo chu trình nhiệt: 94ºC/3 phút, 94ºC/30 giây, 57 ºC/30 giây, 72ºC/1 phút 30 giây; 72ºC/7 phút, 30 chu kì.
Đánh giá sự có mặt của protein do gen chuyển tạo ra
Tiến hành kỹ thuật lai Western kiểm tra sự có mặt của protein do gen chuyển tổng hợp theo phương pháp của Sambrook và đtg (2001) [96].
Dựa trên nguyên lý của phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên (là sản phẩm protein do gen NAC2 mã hóa) và kháng thể đặc hiệu đối với kháng nguyên đó. Trước hết protein toàn phần được chúng tôi tách chiết từ mẫu thuốc lá chuyển gen, điện di trên gel polyacrylamid, thấm truyền lên màng nitrocellulose rồi lai với
kháng thể. Quá trình hiển thị sản phẩm lai thực hiện thông qua phản ứng tạo màu.
Phân tích Western bloting
Sau khi chạy điện di biến tính trên gel polyacrylamide 12,6%, bản gel, giấy lọc và màng PVDF được ổn định 15 phút trong đệm chuyển màng (25mM Tris- HCl, 192 mM glycine, 20% methanol, pH 8,3). Thấm chuyển protein từ gel vào màng lai ở 100V trong 2h, 40C trên máy Minitransbloter (Bio-Rad, Mỹ). Sau đó màng được phủ 2h trong dung dịch TBS (Tris buffer saline: 20mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH 7,5) với 5% skim milk. Rửa màng bằng TTBS 1X, 3 lần, mỗi lần 5 phút. Sau đó rửa lại bằng TBS 1X, 3 lần, mỗi lần 5 phút. Phủ kháng thể 1 kháng cmyc (từ chuột), kháng thể 1 pha loãng 500 lần trong sữa skim milk 5%, lắc ở nhiệt độ phòng trong 3h, lặp lại 2 bước rửa như trên. Phủ kháng thể 2 (anti-mouse-Ig, Horseradish peroxidase) pha loãng 10000 lần trong sữa skim milk 5% trong TBS 1X, lắc ở nhiệt độ phòng trong 1h, lặp lại 2 bước rửa như trên. Hiện màu trong dung dịch hiện màu alkaline. Ủ màng trong dung dịch hiện mà và lắc ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, quan sát màu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/