T H3 ngày hạn 5 ngày hạn 7 ngày hạn 9 ngày hạn
3.4.1.1. Môsẹo hóa và tạo phôi soma
Nhiều nghiên cứu cho thấy, khả năng tạo cụm phôi soma từ phần phôi trục đều chịu ảnh hưởng lớn của nồng độ 2,4D, thời gian tạo phôi soma kéo dài (khoảng 7 tuần)[12], [22], [25], [35], [70].
Chúng tôi lựa chọn giống lạc L12 trong nhóm chịu hạn tốt, L20 thuộc nhóm chịu hạn khá và giống LVTthuộc nhóm chịu hạn kém phục vụ cho nghiên cứu này. L12 là giống lạc sinh trưởng, phát triển rất tốt trong điều kiện nuôi cấy in vitro. Khả năng tạo mô sẹo, tạo đa phôi và tái sinh cây thu được kết quả với tỷ lệ cao. Đây còn là giống có năng suất cao và được trồng phổ biến tại các địa phương. Nhằm cải tạo
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
tính chống chịu của cây lạc với điều kiện bất lợi của môi trường chúng tôi chọn giống lạc chịu hạn kém LVT để thử nghiệm tạo đa phôi và chuyển gen chỉ thị GUS. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D đến sự hình thành phôi soma được thể hiện ở bảng 3.10.
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D đến sự hình thành phôi soma
Sau một tuần nuôi tối, phôi trục cảm ứng tạo thành một khối mô sẹo có kích thước khoảng 3x3x3 mm, màu vàng hơi xanh, không nhớt hoặc trắng xốp. Sau 7 tuần nuôi ngoài sáng chỉ các khối mô sẹo màu vàng, không nhớt mới có khả năng tạo cụm phôi soma. Các phôi màu trắng xốp hoặc nâu đen chỉ phân hóa thành khối mô sẹo nhớt, kích thước tăng dần theo thời gian nuôi cấy.
Ở nồng độ 2,4D 20 mg/l, tỷ lệ tạo phôi soma cao nhất (97,82%) ở giống lạc L12, thấp nhất (82,25%) ở giống lạc LVT. Tỷ lệ này giảm xuống khi nồng độ 2,4-D thấp hoặc cao hơn mức này. Kết quả thí nghiệm của chúng tôi thu được tương tự như đánh giá của Baker và Wetzstein (2002), nồng độ 2,4-D 20mg/l cho khả năng tạo phôi soma cao hơn so với nồng độ 2,4-D 40mg/l [25]. Bùi Văn Thắng và cộng sự (2005) nghiên cứu khả năng tạo phôi soma của giống lạc MD7 dưới ảnh hưởng của các nồng độ 2,4-D khác nhau thấy rằng, tỷ lệ tạo phôi soma cao nhất đạt 95,8%
2,4-D (mg/l) (mg/l)
Tỷ lệ mô sẹo tạo phôi soma (%) (n>=30)
L12 L20 LVT
6 62,41 ± 1,02 36,76 ± 1,84 34,67 ± 1,02 10 86,73 ± 1,19 54,47 ± 1,07 48,97 ± 1,09 10 86,73 ± 1,19 54,47 ± 1,07 48,97 ± 1,09 20 97,82 ± 1,98 88,45 ± 1,68 82,25 ± 1,66 30 75,72 ± 2,02 55,34 ± 1,56 56,64 ± 0,96
Số phôi soma/Phôi nuôi cấy
6 6,55 ± 0,85 3,36 ± 0,74 3,45 ± 0,45 10 9,86 ± 0,38 5,43 ± 0,46 6,54 ± 0,23 10 9,86 ± 0,38 5,43 ± 0,46 6,54 ± 0,23 20 14,94 ± 1,02 8,56 ± 0,79 9,54 ± 0,18 30 4,75 ± 0,93 4,34 ± 0,48 4,23 ± 0,12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
ở nồng độ 20mg/l[12]. Theo Little và đtg (2000), Akins và đtg (2002), kiểu gen của từng giống lạc phản ứng khác nhau với khả năng tạo phôi soma [22], [70].
Số phôi soma trung bình thu được cao nhất là 14,94 phôi (2,4-D 20mg/l) trên một phôi trục ban đầu và thấp nhất là 4,75 (2,4-D 30mg/l) ở giống lạc L12. Cao nhất 9,54 phôi và thấp nhất là 3,45phôi (30mg/l 2,4-D) ở giống lạc LVT. Ở giống L20 số phôi soma trung bình thu được cao nhất là 8,56 phôi, thấp nhất là 3,36 phôi. Phôisoma cónhiều hìnhdạngkhácnhau, nhưngđasốcó hình trụ và nhiềuphôi
đính chung ởphần rễ mầm.
Có thể thấy, nồng độ 2,4-D 20mg/l là nồng độ kích thích sinh trưởng phù hợp trong nghiên cứu của chúng tôi nhằm tạo phôi soma từ phôi trục hạt lạc thông qua quá trình mô sẹo hóa.
Quá trình tái sinh theo con đường sử dụng nguồn mẫu ban đầu trải qua quá trình mô sẹo hóa đã được đề cập đến trong nhiều nghiên cứu trên đối tượng cây lạc
[11], [12], [14], [35]. Các mẫu vật được sử dụng có thể có nguồn gốc từ các phần
mô khác nhau trên cơ thể thực vật như phôi trục, lá non, đoạn thân...Sau khi mẫu cấy được xử lý và đưa lên môi trường tạo mô sẹo thích hợp, thường là chứa chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin (2,4D) với thời gian nuôi cấy nhất định sẽ tạo khối mô sẹo.