Trên cây lạc, nhiều nghiên cứu đã được công bố nhằm xây dựng một hệ thống tái sinh cây hoàn thiện từ nhiều nguồn mẫu ban đầu khác nhau [29], [49], [105], [117], [118]. Tối ưu hệ thống tái sinh là một trong những giai đoạn quyết định ảnh hưởng đến kết quả quá trình chuyển gen. Vì vậy, đây là vấn đề rất được quan tâm khi tiến hành nghiên cứu chuyển gen ở thực vật cũng như trên cây lạc.
Nguồn mẫu vật ban đầu được sử dụng cho các nghiên cứu tái sinh cây ở lạc rất đa dạng như từ phôi hữu tính, lá non, lá mầm, phần trụ của lá mầm, đoạn thân... Các mẫu vật này được sử dụng trong hệ thống tái sinh thông qua hai con đường như ở các đối tượng thực vật khác: tái sinh trực tiếp hoặc qua giai đoạn mô sẹo và tái sinh thông qua hình thành phôi soma trên các môi trường thích hợp.
Tái sinh chồi trực tiếp theo con đường thứ nhất từ mẫu vật là lá mầm, mảnh lá, nách (nốt) lá mầm (cotyledon node) là một trong những phương pháp có hiệu quả được sử dụng gần đây trong tái sinh và chuyển gen ở một số loài thực vật thuộc cây họđậunhư đậu tương [80] và lạc [49], [105], [117], [118]. Giai đoạn cảm ứng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
tạo chồi là giai đoạn quan trọng trong quá trình phát triển chồi trực tiếp từ nách lá mầm. Môi trường cảm ứng tạo chồi ở đa số các loài thực vật thường sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin như IAA, IBA, BAP...Trong đó BAP thuộc nhóm kích thích sinh trưởng cytokinin được sử dụng phổ biến để cảm ứng tạo chồi ở nhiều loài thực vật khác nhau [21], [105]. Akasaka và đtg (2000) đã tái sinh chồi thành công từ mảnh lá giống lạc Chico trên môi trường có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng như BAP, kinetin [21]. Sharma và đtg (2000), đã tái sinh chồi thành công trực tiếp từ nuôi cấy lá mầm trưởng thành của các giống lạc khác nhau với tỷ lệ tái sinh hơn 90% [100]. Swathi và đtg (2006) đã thành công trong việc tái sinh đa chồi trực tiếp từcác mắt lá mầmcủa giống lạc JL-24 với tỷ lệ tái sinh là 82% [105].
Quá trình tái sinh theo con đường thứ nhất sử dụng nguồn mẫu ban đầu trải qua quá trình mô sẹo hóa đã được đề cập đến trong nhiều nghiên cứu trên đối tượng cây lạc [11], [12], [14], [35]. Các mẫu vật được sử dụng có thể có nguồn gốc từ các phần mô khác nhau trên cơ thể thực vật như phôi trục, lá non, đoạn thân...Sau khi mẫu cấy được xử lý và đưa lên môi trường tạo mô sẹo thích hợp, thường là chứa chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin (2,4D) với thời gian nuôi cấy nhất định sẽ tạo khối mô sẹo. Phôi trục là mẫu vật được sử dụng tạo mô sẹo phổ biến hơn cả. Tuy nhiên, quá trình tái sinh cây trực tiếp từ khối mô sẹo có nguồn gốc từ phôi hữu tính cho tỷ lệ đa chồi rất thấp. Thường từ khối mô sẹo chỉ phát sinh được một chồi, chỉ một số ít tạo hai chồi. Điều này là không có ý nghĩa cho quá trình chuyển gen do cần phải có tỷ lệ tái sinh chồi cao nhằm tăng hiệu quả hình thành cây mang gen chuyển như mong muốn. Vì vậy, con đường thứ hai giải quyết vấn đề này là từ khối mô sẹo có thể chuyển lên môi trường tạo phôi soma. Khối phôi soma hình thành trên môi trường thích hợp sẽ được tái sinh tạo cây hoàn chỉnh. Con đường tái sinh này đã làm tăng hiệu quả tạo đa chồi từ một phôi trục hạt lạc [12], [35].
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, trong quá trình phát sinh phôi soma, môi trường có chất kích thích sinh trưởng 2,4D với nồng độ cao cho kết quả tạo phôi soma tốt nhất trên cây lạc [12], [35], [61]. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu đã nhận thấy, việc tối ưu nồng độ và thời gian tiếp xúc với auxin (2,4D) là rất quan trọng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
cho sự hình thành và phát triển của phôi soma [102]. Hệ thống tái sinh cây qua phôi soma hình thành nên hai dạng phôi: phôi soma phát triển bình thường cho cây lạc tái sinh hoàn chỉnh với tần số không lớn và phôi soma phát triển bất thường dẫn đến kết quả không tái sinh được thành cây với tần số cao [12], [61].
Khắc phục hiện tượng phát triển bất thường của phôi soma nhằm tăng tỷ lệ tái sính cây hoàn chỉnh đã được nhiều tác giả đề cập đến trong các nghiên cứu từ khá lâu [12], [35],[61]. Việc kết hợp các chất KTST như BAP và kinetin, BAP và NAA với nồng độ khác nhau đã đem lại kết quả tái sinh tốt từ phôi soma có hình dạng bất thường. Nghiên cứu của Bùi Văn Thắng và đtg (2005), trên môi trường phục hồi phát triển phôi thích hợp, tỷ lệ tái sinh cây thu được rất cao (82%) [12].
Đã có nhiều công trình chuyển gen trên cây lạc được công bố trên thê giới. Nguồn mẫu vật ban đầu được sử dụng phổ biến thường là lá mầm [30], [64], [100], nách lá mầm [29], [105], phôi trục,mô sẹo phôi [24].Ngoài ra lá chét non [93],[97], [111],hoặc trục của lá mầm [89] cũng được sử dụng làm nguồn mẫu vật để chuyển gen. Từ các mẫu vật này, có thể sử dụng phương pháp chuyển gen trực tiếp như bắn gen hoặc chuyển gián tiếp qua Agrobacterium nhằm tạo ra cây lạc chuyển gen mang các tính trạng mong muốn.
1.3.2.2.Một số nghiên cứu chuyển gen mã hóa NAC TF nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây trồng
Những ứng dụng của công nghệ chuyển gen thực vật trong việc nâng cao tính chịu hạn đã đạt được những kết quả bước đầu ở một số loài cây khác nhau như lúa, ngô, đậu tương, lúa mỳ, thuốc lá, cải, Arabidopsis thaliana..., tuy nhiên trên đối tượng cây lạc còn rất ít nghiên cứu chuyển gen được công bố.
Hiện nay có hai xu hướng tìm kiếm các gen liên quan đến tính chống chịu của cây trồng. Hướng thứ nhất là tìm những gen liên quan trực tiếp đến khả năng chịu hạn, chịu lạnh, ngập úng hay phèn mặn... Hướng thứ hai nghiên cứu về gen chống chịu theo hướng các yếu tố điều khiển ví dụ như transcription factor (TF) nhằm tiếp cận cách điều hòa tổng thể hơncủa thực vật khi gặp điều kiện bất lợi [1].
Nhiều nghiên cứu chủ yếu tập trung vào tạo dòng và phân lập các gen liên quan đến hạn hán trong họ NAC TF như: ANAC019, ANAC055, và ANAC072 từ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Arabidopsis[113], BnNAC từ cải bắp[53],AhNAC1, AhNAC2, AhNAC3từ cây lạc [71], [72], SNAC2 được kích hoạt chủ yếu trong quá trình bảo vệ tế bào khỏi sự mất nước [55]. GmNAC2, GmNAC3 và GmNAC4trong đậu tương chứa miền bảo thủ NAC được xác định đã tham gia vào phản ứng với các stress phi sinh học trong đó có hạn[87]. Ở lúa, ONAC045,SNAC1 được cảm ứng bởi hạn hán, nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp,ABA trong lá và rễ [133], OsNAC6 tăng cưởng khả năng chống chịu hạn hán và muối trong lúa. NAC TF ở lúa mì, TaNAC2, TaNAC4, TaNAC8 đã được tìm thấy trong phản ứng với hạn, lạnh, muối, bị thươngtổn và ABA[123]…
Sau khi phân lập, những gen này được thiết kế với các promoter mạnh, đặc hiệu (CaMV35S promoter, rd29A promoter,…) và chuyển thành công vào một số loài thực vật nhờ kỹ thuật chuyển gen. Một số nghiên cứu công bố đã thu được cây trồng chuyển gen thành công có khả năng tăng cường chống chịu các điều kiện thiếu nước của môi trường như: A.thaliana, thuốc lá , lúa …
Phân tích promoter của gen ERD1 cho thấy, các TF thuộc họ NAC đóng vai trò quan trọng đối với sự hoạt hóa của gen ERD1. Quá trình biểu hiện của ba gen
ANAC019, ANAC055, và ANAC072dưới sự điều khiển của promoter ERD1 trong
Arabidopsis cho thấy khả năng chống chịu dưới điều kiện hạn hán đã được tăng cường [113]. Cây Arabidopsis chuyển gen mã hóa một số NAC TFtrong các điều kiện bất lợi khác như nhiệt độ thấp, nhiệt độ cao, khô hạn cũng thu được kết quả tương tự. Nghĩa là, cây chuyển gen mã hóa NAC TF có khả năng chống chịu được các điều kiện bất lợi từ môi trường: mặn, lạnh, hạn và nhiệt độ cao[46], [72].
Nhiều tác giả đã nghiên cứu chuyển gen mã hóa NAC TF thành công vào một số loài cây trồng như ở lúa, ngô, đậu tương, thuốc lá,... Các kết quả thu được đều chứng minhviệc tăng khả năng chống chịu tốt hơn với các điều kiện bất lợi từ môi trường như nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp, nhiệt độ cao, khô hạn, từ đó cải thiện được sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng. Kết quả chuyển gen SNAC1, OsNAC6/SNAC2,
vào lúa cho thấy, khả năng đáp ứng với hạn, lạnh và muối tăng lên[77]. Gen mã hóa
GmNAC2, GmNAC3 và GmNAC4tách từ đậu tương sau khi chuyển vào thuốc lá đã thu được cây chuyển gen tăng khả năng chống chịu với hạn và muối [87].TaNAC2,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
nhiệt độ thấp. Thí nghiệm chuyển gen đã chỉ ra rằng, TaNAC2 làm tăng khả năng chống chịu với hạn, muối và lạnh ở cây Arabidopsis [74].
Ở cây lạc, gen AhNAC2, AhNAC3 được tách dòng thành công và biểu hiện của chúng cho thấy được cảm ứng bởi tình trạng thiếu nước, nồng độ muối cao và nhiệt độ thấp [71]. Gen AhNAC2 đã được chuyển thành công vào Arabidopsis. Tăng cường khả năng chống chịu với hạn và muối đã được quan sát ở cây Arabidopsis
chuyển genqua phân tích Northernblot và RT-PCR [72].
Bảng 1.1. Một số loài cây trồng chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC có khả năng chống chịu tốt với điều kiện bất lợi
Gen Thực vật
chuyển gen Chống chịu stress Nguồn tham khảo
AtNAC019 Arabidopsis Hạn Tran et al., 2004 [113]
AtNAC055 Arabidopsis Hạn Tran et al., 2004 [113]
ATAF1 Arabidopsis Hạn Wu et al., 2009 [1122]
RD26 Arabidopsis Hạn Fujita et al., 2004 [46]
AhNAC2 Arabidopsis Hạn, muối Liu Xu et al., 2011 [72]
TaNAC2 Arabidopsis Hạn, muối, lạnh Mao et al., 2012 [74]
SNAC1 Lúa Hạn, muối Hu et al., 2006 [54]
SNAC2 Lúa Hạn, lạnh, muối Hu et al., 2008 [55]
OsNAC5 Lúa Hạn, lạnh, muối Song et al., 2011 [103]
OsNAC6 Lúa Hạn, muối Nakashima, 2007 [77]
ONAC045 Lúa Hạn, muối Zheng et al., 2009 [133]
ONAC10 Lúa Hạn, lạnh, muối Jeong et al., 2010 [60]
GmNAC2 Thuốc lá Hạn, muối Pinheiro et al., 2009 [87]
GmNAC3 Thuốc lá Hạn, muối Pinheiro et al., 2009 [87]
GmNAC4 Thuốc lá Hạn, muối Pinheiro et al., 2009 [87]
Nhận xét chung
Cây lạc đã được biết đến là cây trồng thuộc nhóm chịu hạn kém. Trong quá trình sinh trưởng phát triển có những giai đoạn rất mẫn cảm với tình trạng thiếu nước như thời kỳ trước ra hoa, thời kỳ ra hoa, thời kỳ đâm tia và tạo quả. Dù gặp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
hạn ở giai đoạn nào cũng gây ảnh hưởng không nhỏ đến sự sinh trưởng bình thường của cây, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng hạt lạc.
Một số biện pháp tăng cường khả năng chịu hạn ở lạc đã được nghiên cứu. Trong đó kỹ thuật chọn tạo các giống lạc có khả năng chịu hạn như lai chọn giống hoặc ứng dụng công nghệ tế bào thực vật đã được áp dụng. Tuy nhiên, việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen ở cây lạc nhằm tạo ra giống lạc có khả năng chịu khô hạn còn chưa được nghiên cứu nhiều. Trên thế giới đã có một số nghiên cứu công bố chuyển gen thành công vào cây lạc. Phương pháp chuyển gen có hiệu quả vào cây lạc qua
Agrobacterium đã được Sharma và đtg đề cập đến trong nghiên cứu của mình từ năm 2000.Bhatnagar và đtg(2007) đã chuyển cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn AtDREB1A tách từ Arabidopsis dưới sự điều khiển của promoter rd29A vào giống lạc JL 24. Kết quả đánh giá cây chuyển gen cho thấy, hiệu quả sử dụng nước cao hơn hẳn so với cây đối chứng trong điều kiện chịu thiếu hụt về nước…
Ở Việt Nam, việc phát triển hệ thống tái sinh cây lạc phục vụ cho mục đíchchuyển gen cũng đã được đề cập trong nghiên cứu của Bùi Văn Thắng và cs (2005), tuy nhiên nghiên cứu chuyển gen ở cây lạc thì chưa có công trình nào được công bố.
Chƣơng 2