M. koenigii chống oxy hóa nhờ khả năng quét gốc tự do DPPH
5 Tác dụng kháng viêm chống viêm, chống ph ù n ề
2.2.4. Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm
Việc thử nghiệm hoạt tính kháng viêm [103], nghiên cứu sự ức chế sự sinh NO của đại thực bào RAW264.7 đã bị kích thích gây viêm bằng nội độc tố LPS, được thực hiện tại Khoa Dược, trường đại học quốc gia Chungnam, Hàn Quốc.
2.2.4.1. Hóa chất Dòng tế bào đại thực bào RAW264.7, mua của hãng ATCC, Hoa kỳ. MTT assay ((3-(4,5-Dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide), Sulfuretin (98.0%) được mua của hãng Sigma-Aldrich, Hoa kỳ. Các hóa chất khác được mua của hãng Invitrogen, Hoa kỳ.
2.2.4.2. Phương pháp xác định nồng độ NO: Đại thực bào RAW264.7 được nuôi trong môi trường DMEM có bổ sung FBS 10%, 100 g/L streptomycin, và 100 IU/mL penicillin được ủ trong tủ ấm ở 37oC, 5% CO2. Thay môi trường nuôi cấy cứ mỗi 48 h / lần. Các chất nghiên cứu được pha trong DMEM (không chứa FBS) ở các nồng độ khác nhau (10; 20 và 40 g/mL) được đưa vào mỗi giếng sao cho tổng thể tích đạt được 500 L / giếng. Sau 1h, tế bào được kích thích bằng 1 g/mL LPS trong 24 h. Nồng độ NO sinh ra trong dịch nuôi cấy đại thực bào sau khi cho tiếp xúc với yếu tố gây viêm LPS sẽ được xác định gián tiếp qua nồng độ NO2 bằng phản ứng Griess. Cụ thể, 100 mL dung dịch nuôi cấy tế bào (không chứa phenol red) được trộn với một thể tích tương đương tác nhân Griess (sulfanilamide 1% (w/v) trong phosphoricacid 5% (v/v) và naphthylethylenediamine-HCl 0.1% (w/v)), ủ tại nhiệt độ phòng trong 10 phút và đo trên máy ELISA ở 540/550 nm. Sulfuretin sử dụng làm chất chuẩn dương. Dịch nuôi cấy được dùng làm chuẩn âm. Lượng nitrite tạo thành trong mẫu được xác định
38
trên đường chuẩn độ NaNO2và suy ra lượng NO tạo thành. Kết quả thu được là giá trị IC50 (g/ml hoặc M) – giá trị ức chế bán phần sự tạo thành NO trong tế bào.
2.2.4.3. Phương pháp xác định khả năng sống sót của tế bào: Các hợp chất chiết tách sẽ được thử nghiệm xác định khả năng sống sót của tế bào theo phương pháp MTT assay để xác định tỷ lệ tế bào còn sống sót sau khi tiếp xúc với chất thử. Cụ thể, các tế bào RAW 264.7 được cấy trên đĩa 96 giếng với mật độ 104 tế bào / giếng. Chất nghiên cứu với các nồng độ khác nhau (10; 20 và 40 M/ml) được đưa vào mỗi đĩa và ủ trong 24h tại 37oC and 5% CO2. Cuối cùng, 10 L MTT (5 mg/mL, trong PBS) được nhỏ vào mỗi giếng. Sự sinh trưởng của tế bào được xác định qua khả năng khử màu vàng của thuốc MTT thành sản phẩm formazan màu tím. Sau khi ủ thêm 3 h nữa, dịch nuôi cấy được loại bỏ. Kết tủa formazan còn lại đáy giếng được hòa tan trong 150 L DMSO và đo trên máy Eliza ở 550 nm. Celastrol được dùng làm chất chuẩn dương.
2.2.4.4. Xử lý số liệu thống kê: Số liệu thể hiện là trung bình của 3 lần đo ± standard deviation (SD). Trong các phép so sánh, P<0.05 được coi là có ý nghĩa. Phân tích thống kê được xử lý theo phương pháp ANOVA followed by Tukey’s test trên phần mềm SPSS 20.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) hoặc Graphpad Prism 6.0 (USA).