M. koenigii chống oxy hóa nhờ khả năng quét gốc tự do DPPH
5 Tác dụng kháng viêm chống viêm, chống ph ù n ề
2.2.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào
Hoạt tính độc tế bào của dịch chiết cây thuốc được đánh giá theo phương pháp so màu, bằng bộ kít thử EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit (Promega, Madison, WI), xác định số tế bào sống dựa trên sự phân hủy muối tetrazolium bởi hệ enzym khử succinate-tetrazolium reductase của chuỗi hô hấp trong mitochondria của tế bào sống tạo thành sản phẩm formazan tan trong nước. Thử nghiệm được thực hiện tại khoa Dược, trường đại học Chungnam, Hàn quốc.
2.2.1.1. Chuẩn bị mẫu thử: Các dịch chiết cây (n-hexane và chloroform) được làm khô trong chân không (ít nhất 12 tiếng), sau đó được pha trong DMSO tại nồng độ 500 mg/mL để chuẩn bị cho phép thử tiếp theo.
2.2.1.2. Hóa chất - Nuôi cấy tế bào: Dòng tế bào ung thư gan hepatocarcinoma HepG2, được giữ trong nitơ lỏng, đánh thức và nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) có bổ sung 5% huyết thanh bê tươi (v/v) FBS và chất kháng sinh penicillin - streptomycin 1% ở 37oC, 5% CO2. Tế bào HepG2 được nuôi trong đĩa 96 giếng ở nồng độ 105 tế bào / giếng, tại 37 °C và 5% CO2. Sau khi ủ 24 giờ, môi trường nuôi cấy tếbào được thay mới nhờbơm hút và Pasteur pipette, sau đó 100 l mẫu chiết cây ở nồng độ 500 g/mL trong phenol-red-free D-MEM được nhỏ vào mỗi giếng. Mẫu chứng dương (blank sample) là DMSO (nồng độ tương đương mẫu cao chiết trong phenol-red-free D-MEM). Mẫu chứng âm là dung dịch nuôi cấy. Mỗi mẫu được thí nghiệm lặp lại trong 5 giếng (n=5). Sau khi ủ tiếp 72 giờ ở 37 °C, 5% CO2, 10l dung dịch kít thử được nhỏ vào mỗi giếng. Ủ tiếp 45 phút trong tủ cấy. Đo hàm lượng formazan tạo thành bằngmáy quang phổ ELISA ở bước sóng 490 nm để tìm giá trị SR(%) (Survival Rate) theo công thức: SR= [OD mẫu thực / OD mẫu chứng] x 100%, trong đó SR là tỷ lệ phần trăm tế bào còn sống trong dung
35
dịch nuôi cấy so với đối chứng ở nồng độ thử xác định của chất nghiên cứu; OD là giá trị hấp thụ bước sóng của mẫu thực và mẫu chứng tương ứng đo được.
2.2.1.3. Xử lý số liệu Số liệu nghiên cứu được xử lý và tính toán trên phần mềm Microsoft Excel.