M. koenigii chống oxy hóa nhờ khả năng quét gốc tự do DPPH
5 Tác dụng kháng viêm chống viêm, chống ph ù n ề
2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme thủy phân epoxide hòa tan (soluble epoxide hydrolase (sEH) inhibition assay)
(soluble epoxide hydrolase (sEH) inhibition assay)
Tác dụng ức chế các enzyme sEH được thực hiện theo phương pháp đo huỳnh quang, đo hoạt độ enzyme sEH xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất phát huỳnh quang
36
trong sự có mặt / vắng mặt chất nghiên cứu [102]. Thử nghiệm được thực hiện tại Khoa Dược, trường đại học quốc gia Chungnam, Hàn Quốc.
2.2.3.1. Hóa chất – Nguyên liệu Chất phát huỳnh quang 3-phenyl-cyano(6-methoxy-2- naphthalenyl)methyl ester-2-oxiraneacetic acid (PHOME), chất chuẩn 12- [[(tricyclo[3.3.1.13,7]dec-1-ylamino)carbonyl]amino]-dodecanoic acid (AUDA), enzyme sEH tinh khiết và 6-methoxy-2-naphtaldehyde (chất nội chuẩn cho fluorometric assays) được mua của hãng Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Enzyme được chuẩn bị trong những ống nhỏ, bảo quản lạnh ở nhiệt độ -10 oC và chỉ được làm rã đông ngay trước khi sử dụng. Các phản ứng được thực hiện trong khí quyển khí N2khô và được kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng (TLC) Merck F254 silica gel 60 đế nhôm, các điểm chất phản ứng được nhận biết nhờ ánh sáng tử ngoại UV bước sóng 254 và 365 nm.
Thể tích phản ứng là 200 μL, bao gồm 80 μL dung dịch đệm Bis-Tris buffer 25 mM (chứa 0.1% huyết thanh bò (bovine serum albumin), pH 7.0), 20 μL mẫu các nồng độ khác nhau, 50 L dung dịch PHOME 40 M, 50 L sEH enzyme. Dịch chuẩn AUDA (hòa tan trong MeOH, 15 nM) làm chứng dương. Ống phản ứng được điều nhiệt ở 37°C trong 1 h, và đo huỳnh quang 2 phút / lần (trong vòng 1h) bằng thiết bị Genios microplate reader (Tecan, Männedorf, Switzerland) ở bước sóng kích thích / phát xạ (excitation/emission wavelengths) 320 và 465 nm. Hoạt độ ức chế enzyme sEH cho mỗi mẫu được tính toán theo phương trình:
Hoạt độ enzyme sEH (%) =[(S-So)/(C-Co)] x 100
trong đó C là cường độ huỳnh quang mẫu chứng (enzyme, dung dịch đệm, MeOH và cơ chất) sau khi ủ 60 phút, Co là cường độ huỳnh quang của mẫu chứng tại thời điểm bắt đầu phản ứng; S là là cường độ huỳnh quang mẫu đo (enzyme, dung dịch đệm, dung dịch mẫu và cơ chất) sau khi ủ 60 phút, So là cường độ huỳnh quang của mẫu chứng tại thời điểm bắt đầu phản ứng. Giá trị IC50 là nồng độ chất thử tại đó hoạt độ của enzyme sEH bị ức chế 50% hoạt độ, được xác định bằng độ tuyến tính của 4 – 5 điểm dữ liệu trên đường cong độ hấp thụ huỳnh quang tìm được. Các thông số động học enzyme Km (nồng độ cơ chất tại đó tốc độ thủy phân cao nhất) và Vmax (tốc độ thủy phân cơ chất cao nhất) được tính toán theo phương trình Michaelis-Menten.
37
2.2.3.3. Xử lý số liệu thống kê Các số liệu được trình bày dạng chỉ số trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). Trong các phép so sánh, P<0.05 được coi là có ý nghĩa. Hoạt độ sEH trong sự có mặt của các chất nghiên cứu sẽ được trình bày dạng phần trăm so với giá trị từ mẫu chứng. Giá trị IC50 tính toán được từ đường biễu diễn và phương trình Hill (Hồi quy không tuyến tính) (non-linear regression) với giá trị phương sai thấp nhất; Km và Vmaxđược tính toán theo phương trình Michaelis-Menten, tính trên phần mềm GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Sự sai khác thống kê giữa các nhóm được phân tích bằng chương trình ANOVA tiếp theo là phép so sánh Dunnett’s (P < 0.05).