a. Ảnh hưởng của phương pháp trích ly đến hiệu quả trích ly
Phương pháp trích ly ảnh hưởng rất lớn đến khả năng trích ly các hoạt chất hòa tan có trong nấm Đầu khỉ. Nếu chọn được một phương pháp thích hợp thì sẽ tách triệt để các chất và cho hiệu suất cao. Tuy nhiên, mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm riêng nên cần nghiên cứu để tìm ra một phương pháp tốt nhất. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với 3 phương pháp trích ly sau:
Công thức Phương pháp trích ly
CT1 Ngâm ở điều kiện thường CT2 Trích ly cách thủy CT3 Trích ly bằng soxhlet
Nấm Đầu Khỉ được trích ly ở cùng một điều kiện. Để dễ dàng cho nghiên cứu chúng tôi cố định các điều kiện sau:
- Khối lượng mẫu: 10g
- Kích thước nguyên liệu : Theo mục 3.4.3.1.a - Dung môi: Theo mục 3.4.3.2. a
- Nồng độ dung môi: Theo mục 3.4.3.2.b
- Tỷ lệ nguyên liệu trên dung môi: Theo mục 3.4.3.2.c - Nhiệt độ trích ly: 600
C - Thời gian trích ly: 3h
Mỗi công thức lặp lại 3 lần. Dịch trích ly thu được đem lọc, đo OD để xác định hàm lượng Diterpenoid. Từ đó sẽ tìm được phương pháp trích ly tối ưu cho hiệu quả cao nhất. Thí nghiệm này nhằm xác định được phương pháp trích ly thích hợp nhất cho quá trình trích ly Diterpenoid và là cơ sở cho các thí nghiệm tiếp theo.
b. Nghiên cứu xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình trích ly Diterpenoid
Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến quá trình trích ly do đó cần xác định được nhiệt độ thích hợp nhất. Chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ trích ly ở các mốc nhiệt độ theo 4 công thức sau:
Công thức Nhiệt độ (0C)
CT1 50
CT2 60
CT3 70
CT4 80
Nấm Đầu Khỉ được đem trích ly ở cùng điều kiện. Ban đầu chúng tôi cố định các điều kiện để dễ dàng cho nghiên cứu:
- Khối lượng mẫu: 10g
- Kích thước nguyên liệu: Mục 3.4.3.1.a - Dung môi: Theo mục 3.4.3.2.a
- Nồng độ dung môi: Theo mục 3.4.3.2.b - Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi: Mục 3.4.3.2.c - Phương pháp trích ly: Theo mục 3.4.3.3.a - Thời gian trích ly: 3h
Dịch trích ly thu được đem lọc qua giấy lọc thô 2 lần và lọc qua giấy lọc tinh 1 lần. Sau đó đo OD ở bước sóng 610nm để xác định hàm lượng Diterpenoid, các thí nghiệm lặp lại 3 lần.Từ thí nghiệm tìm ra được nhiệt độ thích nhất cho quá trình trích ly Diterpenoid và làm cơ sở cho các thí nghiệm sau.
c. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hiệu quả trích ly Diterpenoid
Thời gian có ảnh hưởng đến quá trình trích ly. Nếu thời gian chiết ngắn sẽ không chiết hết hoạt chất trong nguyên liệu, nếu thời gian trích ly quá dài, dịch trích
ly sẽ lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản. Do đó cần phải lựa chọn được thời gian thích hợp cho quá trình trích ly. Chùng tôi tiến hành thí nghiệm ở các mốc thời gian theo 3 công thức sau:
Công thức Thời gian (giờ)
CT1 3
CT2 4
CT3 5
Nấm Đầu Khỉ được đem trích ly cách thủy ở cùng điều kiện. Ban đầu chúng tôi cố định các điều kiện để dễ dàng cho nghiên cứu:
- Khối lượng mẫu: 10g
- Kích thước nguyên liệu: Mục 3.4.3.1.a - Dung môi: Theo mục 3.4.3.2.a
- Nồng độ dung môi: Theo mục 4.4.3.2.b - Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi: Mục 3.4.3.2.c - Phương pháp trích ly: Theo mục 3.4.3.3.a - Nhiệt độ trích ly: Theo mục 3.4.3.3.b
Dịch trích ly thu được đem lọc qua giấy lọc thô 2 lần và lọc qua giấy lọc tinh 1 lần. Sau đó đo OD ở bước sóng 610nm để xác định hàm lượng Diterpenoid, các thí nghiệm lặp lại 3 lần.Từ thí nghiệm tìm ra được thời gian thích hợp nhất cho quá trình trích ly Diterpenoid và làm cơ sở cho các thí nghiệm sau.
d. Nghiên cứu ảnh hưởng của số lần trích ly đến hiệu quả trích ly Diterpenoid
Sau khi trích ly lần 1, tiến hành lọc dịch trích ly loại bã. Bã trích ly của lần 1 được tiếp tục đem đi trích ly tiếp nhằm trích ly triệt để hàm lượng Diterpenoid có trong nấm Đầu Khỉ. Chúng tôi tiến hành thí nghiêm theo 2 công thức sau:
Công thức Số lần trích ly
CT1 2
CT2 3
Nấm Đầu Khỉ được trích ly ở cùng một điều kiện. Để dễ dàng cho nghiên cứu chúng tôi cố định các điều kiện sau:
- Khối lượng mẫu: 10g
- Kích thước nguyên liệu: Mục 3.4.3.1.a - Dung môi: Theo mục 3.4.3.2.a
- Nồng độ dung môi: Theo mục 4.4.3.2.b - Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi: Mục 3.4.3.2.c - Phương pháp trích ly: Theo mục 3.4.3.3.a - Nhiệt độ trích ly: Theo mục 3.4.3.3.b - Thời gian trích ly: Theo mục 3.4.3.3.c
Dịch trích ly thu được đem lọc qua giấy lọc thô 2 lần và lọc qua giấy lọc tinh 1 lần. Sau đó đo OD ở bước sóng 610nm để xác định hàm lượng Diterpenoid, các thí nghiệm lặp lại 3 lần.Từ thí nghiệm tìm ra được số lần trích ly nhằm trích ly được triệt để nhất hàm lượng Diterpenoid có trong nấm Đầu Khỉ.
3.4.4.4. Lọc, cô dịch trích ly và thu nhận chế phẩm Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ
Dịch trích ly của nấm Đầu Khỉ sau khi trích ly xong sẽ lẫn rất nhiều tạp chất, và vẩn đục. Vì vậy, trước khi đem đi cô dịch cần phải lọc để đảm bảo dịch chiết trong, không lẫn các tạp chất khác mà chỉ chứa các chất hòa tan có trong nấm. Sau đó, chúng tôi tiến hành cô dịch trên thiết bị chân không ở áp suất -0,8atm với các mốc nhiệt độ như sau:
Công thức Nhiệt độ (0C) CT1 50 CT2 60 CT3 70 CT4 80 CT5 90
Dịch thô sau khi cô được lấy mẫu đi đo mật độ OD ở bước sóng 610nm để xác định hàm lượng Diterpenoid.
Thí nghiệm xác định được nhiệt độ cô đặc phù hợp nhất cho quá trình thu nhận chế phẩm diterpenoid từ nấm Đầu Khỉ.
Phần 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện xử lý nguyện liệu đến hiệu quả trích ly Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ
4.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu suất trích ly Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ
Kích thước nguyên liệu là một trong những yếu quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả trích ly các chất trong nấm Đầu Khỉ. Bình thường các hợp chất được giữ trong tế bào, chúng rất khó được tách ra nếu không có các tác động của yếu tố bên ngoài. Việc nghiền nhỏ nguyên liệu có tác dụng làm cho tế bào bị phá vỡ, từ đó giúp các chất dễ dàng khuếch tán ra ngoài môi trường. Tạo điều kiện cho quá trình trích ly dễ dàng và triệt để hơn.
Thí nghiệm này xác định ảnh hưởng của nguyên liệu tới việc trích ly các hoạt chất Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ được tiến hành như trong phần 3.4.3.1a. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 4.1 và đồ thị 4.1.
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu suất trích ly Diterpenoid Kích thước nguyên liệu (mm) Hàm lượng Diterpenoid (mg/g) d ≤ 2 0,177a 2 < d ≤ 5 0,175a 5 < d ≤ 10 0,149b d > 10 0,128c
(Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau ở
Đồ thị 4.1. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu quả trích ly Diterpenoid
Qua bảng 4.1và đồ thị 4.1 ta thấy: Các kích thước nguyên liệu khác nhau sẽ thu được hàm lượng Ditrepenoid khác nhau có ý nghĩa ở mức ý nghĩa 5%. Nguyên liệu càng mịn thì hàm lượng Diterpenoid thu được càng cao.
Nguyên liệu có kích thước d > 10 mm chỉ cho lượng Diterpenoid thấp nhất là 0,128 mg/g. Nguyên liệu ở kích thước 5 < d ≤ 10 mm cho hiệu quả trích ly đứng thứ 3 với lượng diterpenoid là 0,149 mg/g. Nguyên liệu có kích thước đến 2 < d ≤ 5 mm cho hàm lượng Diterpenoid là 0,175 mg/g. Nguyên liệu có kích thước d ≤ 2 mm thu được hàm lượng Diterpenoid cao nhất với lượng Diterpenoid là 0,177 mg/g. Tuy nhiên, cao hơn không đáng kể so với nguyên liệu có kích thước đến 2 < d ≤ 5 mm là 0,002. Điều này chứng tỏ, nguyên liệu có kích thước càng nhỏ thì lượng hoạt chất thu được càng cao.
Nguyên nhân là do nguyên liệu ở kích thước lớn thì mức độ phá vỡ tế bào nguyên liệu thấp, dung môi khó thấm sau vào trong nguyên liệu dấn đến hiệu quả trích ly thấp. Nguyên liệu có kích thước nhỏ mức độ phá vỡ tế bào lớn dung môi dễ dàng thấm sau vào trong nguyên liệu giúp giải phóng các chất tan trong tế bào ra ngoài môi trường dễ dàng, dẫn đến hiểu quả trích ly cao. Tuy nhiên không nên nghiền nguyên liệu quá nhỏ, vì nó sẽ ảnh hưởng đến quá trình lọc, gây tốn năng
lượng và công sức. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn kích thước nấm Đầu Khỉ thích hợp nhất là 2 < d ≤ 5 mm và sử dụng kết quả này cho các nghiên cứu sau.
4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi đến hiệu quả trích ly Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ trong nấm Đầu Khỉ
4.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của loại dung môi đến hiệu quả trích ly Diterpenoid
Dung môi để hoà tan các chất cần trích ly và hạn chế hòa tan các tạp chất, do đó dung môi có ảnh hưởng lớn tới chất lượng của dịch trích ly và thành phẩm. Việc lựa chọn dung môi thích hợp là hết sức quan trọng. Dựa trên tính chất vật lý (độ nhớt, sức căng bề mặt, độ phân cực) và đặc tính hoà tan chọn lọc của dung môi đối với hoạt chất để lựa chọn dung môi. Lựa chọn dung môi cho việc trích ly các sản phẩm dùng cho thực phẩm, ngoài yếu tố hoà tan chọn lọc cao, độ nhớt thấp, sức căng bề mặt nhỏ, còn lưu ý đến tính độc của dung môi, quan tâm đến vấn đề kinh tế, rẻ tiền và dễ kiếm.
Diterpenoid là chất tan trong các dung môi hữa cơ và dựa vào một số nghiên cứu trước đây, chúng tôi lựa chọn khảo sát trích ly với 3 loại dung môi: Methanol, acetone, ethanol. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 4.2 và đồ thị 4.2.
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của dung môi đến hiệu quả trích ly Diterpenoid Dung môi Hàm lượng diterpenoid
(mg/g)
Acetone 0,161b
Ethanol 0,175a
Methanol 0,176a
(Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau ở
Đồ thị 4.2. Ảnh hưởng của dung môi đến hiệu quả trích ly Diterpenoid
Qua kết quả ở bẳng 4.2 và đồ thị 4.2 ta thấy, nầm Đầu Khỉ trích ly bằng các dung môi khác nhau cho hàm lượng Diterpenoid khác nhau. Nấm Đầu Khỉ được trích ly bằng acetone cho hàm lượng Diterpenoid thấp nhất là 0,161 mg/g, trích ly bằng ethanol cho hàm lượng Diterpenoid là 0,175 mg/g và sử dụng dung môi là methanol cho hàm lượng Diterpenoid là 0,176 mg/g cao hơn so với dung môi ethanol là 0,001 mg/g. Trong hai loại dung môi ethanol và methanol mặc dù có giá trị không chênh lệch nhau là mấy chỉ một khoảng nhỏ là 0,001 mg/g nhưng việc chọn dung môi cho việc trích ly các sản phẩm dùng cho thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm thì ngoài các yếu tố tính hòa tan chọn lọc cao, độ nhớt thấp, sức căng bề mặt nhỏ mà người ta còn lưu ý đến tính độc hại của dung môi, giá thành kinh tế.
Ethanol là một dung môi dễ kiếm, sử dụng rất tiện lợi và đặc biệt là nó khá an toàn và rẻ tiền hơn so với methanol. Vì vậy ở đây chúng tôi lựa chọn dung môi trích ly cho quá trình trích ly Diterpenoid từ nấm Đầu Khỉ là ethanol dụng kết quả này cho các nghiên cứu sau.
4.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hiệu quả trích ly Diterpenoid
Ethanol là một trong những dung môi có khả năng trích ly các hoạt chất sinh học ra khỏi nguyên liệu khá tốt. Hơn nữa, ethanol có khả năng bảo quản được dịch trích ly không bị hỏng trong thời gian dài. Tuy nhiên nồng độ ethanol ảnh hưởng lớn
đến khả năng trích ly Diterpenoid từ nấm Đầu Khỉ. Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu quả trích ly thu được kết quả ở bảng 4.3 và đồ thị 4.3.
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hiệu quả trích ly Diterpenoid Nồng độ dung môi (%) Hàm lượng diterpenoid (mg/g) 80 0,175d 85 0,184c 90 0,192b 96 0,207a
(Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau ở
mức ý nghĩa α = 0,05)
Đồ thị 4.3. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hiệu quả trích ly Diterpenoid
Qua kết quả thu được ở bảng 4.3 và đồ thị 4.3 ta thấy, dung môi có nồng độ khác nhau cho hàm lượng Diterpenoid khác nhau, nồng độ dung môi càng cao hàm lượng Diterpenoid càng lớn càng lớn. Ta thấy sử dụng ethanol có nồng độ 96% cho hàm lượng Diterpenoid cao nhất là 0,207 mg/g. Hàm lượng Diterpenoid thu được khi trích ly bằng ethanol có nồng độ 80% là thấp nhất, tương ứng với 0,175 mg/g. Khi nồng độ dung môi càng giảm thì hàm lượng Diterpenoid thu được cũng giảm do:
Ethanol phá hủy nguyên sinh chất của tế bào nấm, thấm sâu vào bên trong, làm tăng khả năng khuếch tán chất tan trong tế bào ra môi trường bên ngoài.Nồng độ ethanol thấp làm giảm khả năng phá hủy tế bào nấm, do đó diện tích tiếp xúc với dung môi sẽ nhỏ đi, khả năng trích ly giảm.
Ngoài ra, nồng độ dung môi càng thấp thì nước trong dung môi càng nhiều. Nước sẽ thấm vào tế bào làm nó trương nở đồng thời tác dụng với protein và các chất háo nước khác ngăn cản sự dịch chuyển của dung môi thấm sâu vào trong nguyên liệu, làm chậm quá trình khuếch tán còn các chất tan thì không khuếch tán ra được ra ngoài môi trường. Do đó, lượng chất trích ly thu được càng ít.
Vì vậy, chúng tôi lựa chọn dung môi trích ly có nồng độ là 96% cho quá trình trích ly Diterpenoid từ nấm Đầu Khỉ dụng kết quả này cho các nghiên cứu sau.
4.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hiệu quả trích ly Diterpenoid ly Diterpenoid
Lượng dung môi nhiều hay ít đều ảnh hưởng tới quá trình các chất trong nguyên liệu. Nếu lượng dung môi quá ít thì chỉ đủ để thấm ướt nguyên liệu vì vậy hiệu suất trích ly sẽ thấp. Ngược lại, nếu lượng dung môi sử dụng quá nhiều thì gây hao phí dung môi, nhiên liệu trong quá trình lọc cô và các chi phí khác. Vì vậy, việc lựa chọn tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là rất cần thiết cho quá trình trích ly, thu sản phẩm. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo các bước trong phần 3.4.2.b và thu được các kết quả ở bảng 4.4 và đồ thị 4.4.
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hiệu quả trích ly Diterpenoid Tỷ lệ NL/DM Hàm lượng diterpenoid (mg/g) 1/10 0,127c 1/15 0,139b 1/20 0,207a 1/25 0,209a
(Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chỉ số mũ khác nhau thì khác nhau ở
Đồ thị 4.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liêu/dung môi tới hiệu quả trích ly Diterpenoid
Qua bảng 4.4 ta thấy: Ở các tỷ lệ dung môi khác nhau cho hàm lượng hoạt chất Diterpenoid khác nhau. Khi tỷ lệ nguyên liệu/dung môi giảm tức là dung môi sử dụng tăng, Diterpenoid và các chất tan có điều kiện hòa tan tốt vào dung môi bởi lượng dung môi lớn sẽ làm tăng khả năng tiếp xúc của tế bào với dùng môi, từ đó làm tăng sự chênh lệch nồng độ giữa môi trường bên trong và bên ngoài tế bào nấm. Từ đó làm tăng sự chênh lệch áp suất thẩm thấu và sự khuếch tán của các chất tan có trong tế bào nấm ra dung môi trích ly, làm cho hàm lượng chất tan và Diterpenoid có