Khi nguyên liệu và dung môi tiếp xúc nhau, lúc đầu dung môi vào trong dược liệu, sau đó hoạt chất trong tế bào hòa tan vào dung môi, khi đó xuất hiện quá trình thẩm thấu giữa dung dịch trích ly trong thành tế bào và dung môi bên ngoài. Hoạt chất được khuếch tán ra ngoài tế bào. Trong quá trình trích ly thường xảy ra một số quá trình: khuếch tán, thẩm thấu, thẩm tích.
2.3.4.1. Quá trình khuếch tán
Quá trình di chuyển vật chất từ pha này sang pha khác khi hai pha tiếp xúc trực tiếp nhau gọi là quá trình khuếch tán (quá trình chuyển khối). Quá trình tách
chất hòa tan trong nguyên liệu bằng dung môi chính là quá trình trích ly và nguyên liệu là pha rắn, dung môi là pha lỏng.
Khi hai pha chuyển động tiếp xúc nhau thì trên bề mặt phân chia pha tạo thành lớp màng, ở lớp màng luôn có chế độ chuyển động dòng và ở giữa dòng có thể có chuyển động xoáy. Đặc trưng di chuyển vật chất trong màng và trong nhân của dòng khác nhau.
Trong lớp màng, quá trình di chuyển vật chất cơ bản là nhờ sự tiếp xúc giữa các phân tử và sự tác dụng tương hỗ giữa chúng, do đó quá trình khuếch tán qua màng được gọi là quá trình khuếch tán phân tử. Trong nhân, quá trình di chuyển vật chất nhờ sự xáo trộn các phân tử của dòng, vì thế gọi là khuếch tán đối lưu.
Quá trình khuếch tán trong lớp màng xảy ra rất chậm so với quá trình khuếch tán trong nhân của dòng, do đó mặc dù lớp màng rất mỏng nhưng vẫn có giá trị quyết định đối với quá trình khuếch tán. Vận tốc khuếch tán chung phụ thuộc nhiều vào vận tốc khuếch tán trong màng.
2.3.4.2. Quá trình thẩm thấu
Là quá trình khuếch tán giữa hai pha lỏng qua một màng có tính chất bán thấm, có nghĩa là màng chỉ cho dung môi đi qua mà không cho chất tan đi qua. Màng đó gọi là màng bán thấm. Do áp lực thẩm thấu của các phân tử chất tan, dung môi sẽ được thấm từ pha lỏng có nồng độ chất tan thấp hơn sang pha lỏng có nồng độ cao hơn, cho đến khi áp suất thủy tĩnh cân bằng với áp lực thẩm thấu.
Ứng dụng: Trong tế bào nguyên liệu có chất nguyên sinh có tính bán thấm, vì vậy khi còn tươi chỉ có dung môi thấm được vào tế bào, làm cho nguyên liệu bị trương nở, còn chất tan trong tế bào không khuếch tán ra ngoài được. Do đó trong trích ly, người ta tìm cách phá hủy nguyên sinh chất bằng nhiệt hoặc cồn để thực hiện quá trình trích ly.
2.3.4.3. Quá trình thẩm tích
Là quá trình khuếch tán giữa hai pha lỏng qua một màng có tính chất thẩm tích, có nghĩa là màng không chỉ cho dung môi đi qua mà còn cho cả chất tan đi qua, nhưng chỉ cho qua các phân tử nhỏ.
Ứng dụng: Màng tế bào nguyên liệu có tính chất của một màng thẩm tích, do đó khi trích ly nếu màng tế bào còn nguyên vẹn thì chỉ có chất tan là phân tử nhỏ và ion (phần lớn là hoạt chất) khuếch tán qua màng tế bào, còn các chất có phân tử lớn (thường là chất keo, tạp chất…) thì không qua được màng tế bào nên không bị chiết vào dịch chiết. Như vậy có thế coi màng tế bào như một màng lọc sinh học có tính chọn lọc. Đây chính là ưu điểm của màng tế bào đối với quá trình trích ly. Do đó, trong quá trình trích ly không nên xay quá mịn, vì khi đi màng tế bào bị phá vỡ, tính chọn lọc của màng tế bào không còn, dịch chiết lẫn nhiều tạp, gây khó khăn cho quá trình nghiên cứu về sau.
2.4. Thu nhận các hoạt chất sinh học của nấm Đầu Khỉ
2.4.1. Cô đặc
Cô đặc là phương pháp dùng để nâng cao nồng độ các chất hoà tan trong dung dịch gồm 2 hai nhiều cấu tử. Quá trình cô đặc của dung dịch lỏng - rắn hay lỏng - lỏng có chênh lệch nhiệt độ sôi rất cao thường được tiến hành bằng cách tách một phần dung môi (cấu tử dễ bay hơi hơn); đó là các quá trình vật lý - hoá lý. Tùy theo tính chất của cấu tử khó bay hơi (hay không bay hơi trong quá trình đó), ta có thể tách một phần dung môi (cấu tử dễ bay hơi hơn) bằng phương pháp nhiệt độ (đun nóng) hoặc phương pháp làm lạnh kết tinh. Quá trình cô đặc gồm các phương thức sau:
Cô đặc áp suất thường (thiết bị hở): nhiệt độ sôi và áp suất không đổi; thường được dùng trong cô đặc dung dịch liên tục để giữ mức dung dịch cố định, nhằm đạt năng suất cực đại và thời gian cô đặc ngắn nhất.
Cô đặc áp suất chân không: Dung dịch có nhiệt độ sôi thấp ở áp suất chân không. Dung dịch tuần hoàn tốt, ít tạo cặn và sự bay hơi dung môi diễn ra liên tục.
Cô đặc nhiều nồi: Số nồi không nên quá lớn vì nó làm giảm hiệu quả tiết kiệm hơi. Người ta có thể cô chân không, cô áp lực hay phối hợp cả hai phương pháp. Đặc biệt có thể sử dụng hơi thứ cho mục đích khác để nâng cao hiệu quả kinh tế.
Cô đặc liên tục: cho kết quả tốt hơn cô đặc gián đoạn. Tuỳ theo điều kiện kỹ thuật và tính chất của dung dịch, ta có thể áp dụng chế độ cô đặc ở áp suất chân không, áp suất thường hoặc áp suất dư.
2.4.2. Sấy thu nhận sản phẩm
Một số phương pháp sấy:
Sấy đối lưu là phương pháp dùng khá phổ biến trong sản xuất, sử dụng tác nhân sấy là khí nóng, vừa làm nhiệm vụ truyền nhiệt vừa lấy ẩm ra khỏi vật liệu. Tác nhân sây có nhiều dạng khác nhau, tùy thuộc vào kiểu máy sấy.
Sấy tiếp xúc là một hệ thống chuyên dùng. Vật liệu nhận trực tiếp từ bằng dẫn nhiệt hoặc từ một bề mặt nóng hoặc từ môi trường chất nóng. Người ta chia hệ thống tiếp xúc thành 2 loại: Loại tiếp xúc trong chất lỏng và loại tiếp xúc bề mặt. Nguyên tắc cơ bản của thiết bị sấy tiếp xúc là quá trình gia nhiệt, vật liệu sấy tiếp xúc trực tiếp với bề mặt gia nhiệt.
Sấy bức xạ là phương pháp sấy dùng tia bức xạ chiếu vào đối tượng cần làm khô. Nguồn nhiệt bức xạ thường dùng đèn hồng ngoại, điện trở, chất lỏng hay khí, tấm được đốt nóng ở nhiệt độ nhất định, để vật nóng phát ra tia hồng ngoại.
Sấy thăng hoa là quá trình tách ẩm khỏi vật liệu sấy trực tiếp từ trạng thái rắn sang trạng thái rắn sang trạng thái hơi nhờ quá trình sấy thăng hoa. Để tạo điều kiện sấy thăng hoa, vật liệu sấy phải được làm lạnh dưới điểm ba thể (lỏng, rắn, khí), nhiệt độ t = 0,00980C và áp suất p = 4,6mmHg.
2.5. Các sản phẩm chế biến từ nấm Đầu Khỉ
Theo các nhà khoa học trên thế giới nấm Đầu Khỉ chứa rất nhiều hoạt chất sinh họccó có lợi cho sức khỏe con người. Với phương pháp truyền thống, loại thảo dược này có trong các bài thuốc đông y và sắc lấy nước uống. Ngày nay, với sự phát triển của công nghệ sinh học phát triển và đặc biệt là sự phát triển của các sản phẩm thực phẩm chức năng. Các dạng thương phẩm của nấm Đầu Khỉ trên thi trường chủ yếu dưới hình thức bột nấm, dạng khô, hoặc kết hợp cùng các loại nấm khác tạo thành dạng viên nén
Hình 2.2. Nấm hầu thủ dạng viên nang Hình 2.3. Nấm hầu thủ dạng khô
2.6. Tình hình sản xuất và nghiên cứu nấm Đầu Khỉ trên thế giới và Việt Nam
2.6.1. Tình hình sản xuất và nghiên cứu nấm Đầu Khỉ trên thế giới
Ngay từ đầu thế kỷ thứ 19 nấm Đầu Khỉ được biết đến như một loại nấm ăn mang giá trị dinh dưỡng cao, đồng thời còn là nguồn dược liệu quý. Tới năm 1960 nấm Đầu Khỉ được nuôi trồng thành công, nhưng phải hơn 40 năm sau tức là gần 10 năm trở lại đây mới phát triển.
Tính đến năm 1991, tổng sản lượng nuôi trồng nấm Đầu Khỉ trên thế giới là 66.000 tấn nấm tươi, chỉ chiếm 1,2% so với tổng lượng nấm trên toàn thế giới, và còn rất thấp đối với nhu cầu của thị trường. Nói chung, từ năm 1981 đến 1997 sản lượng trồng nấm Đầu Khỉ tăng lên ít, trong những báo cáo về tình hình nuôi trồng nấm trên thế giới sản lượng vẫn bị xếp chung vào cùng các loài nấm khác. Nhận thấy tiềm năng về mặt sinh học của nấm Đầu Khỉ, là thực phẩm chức năng có giá trị dinh dưỡng cao, được chiết xuất thành các chế phẩm y dược. Một số nước châu Âu, châu Mỹ bắt đầu quan tâm đến việc nuôi trồng loài nấm này Hoa Kỳ, Pháp… Sản lượng nấm Đầu Khỉ trên trên thế giới tăng một cách đáng kể trong năm 2003, đứng đầu về sản lượng nuôi trồng là Trung Quốc với sản lượng 30.500 tấn, tiếp theo là Nhật Bản với sản lượng 1.821 tấn. Năm 2004 sản lượng nấm Đầu Khỉ tăng mạnh ở Hoa Kì với sản lượng lên tơi 42.5 tấn [16].
Năm1995, Pan Jihong Li và cộng sự, đã nghiên cứu các phương pháp trích ly Polysaccharides của quả thể nấm Đầu Kkhỉ bằng các dung môi khác nhau: Bằng nước, dung dịch ammonium oxalate 0,5% và dung môi NaOH 1N, kết quả cho thấy
trích ly bằng dung môi NaOH 1N đạt 30,8% so với tổng số Polysacchrides và xác định được thành phần Polysacchrides bao gồm: D-mannose, D-galactose, U-glucose và D-xylose [20].
Năm 2009, Han Wei và cộng sự, đã đưa ra được quy trình trích ly nấm Đầu khỉ ở nhiệt độ 850C trong 4h với dung môi ethanol, thu hồi Polysaccharides bằng phương pháp tửa với ethanol 75%, lượng Polysaccharides này có vai trò quan trọng đối với hệ miễn dịch khi kích hoạt tế bào LAK và IL-2 [12].
Năm 2009, HU Bin-jie, SHI Zhao-zhong, Trung Quôc, đã sử dụng phương pháp siêu âm trong trích ly Polysaccarides từ nấm Đầu Khỉ ở điều kiện cơ chất/ dung môi nước = 1/15, 500C, 2 giờ trích ly. Cho hiệu suât trích ly đạt trên 40% (so với tổng số Polyasaccharides), thời gian trích ly ngắn hơn phương pháp trích ly bằng nước nóng truyền thống là 4-5 lần [13].
Năm 2010, Zhang Shuai và cộng sự, đã nghiên cứu trích ly Polysaccharides từ nấm Đầu Khỉ, sử dụng hỗn hợp enzyme bao gồm các cellulase và pectinase (tỷ lệ khối lượng 1:2). Các điều kiện quá trình thủy phân được xác định bằng cách kiểm tra đơn yếu tố và sau đó tối ưu hóa điều kiện quá trình, xác định được: pH 4,2, nhiệt độ 500C, thời gian phản ứng 90 phút và 2,0% enzyme, điều kiện tối ưu…lượng Polysaccharidese trích ly được là 4,38%, so với các phương pháp khác, phương pháp trích ly có hỗ trợ bằng enzyme là phương pháp trích ly Polysaccharides được đơn giản, nhanh chóng và cho trích ly tỷ lệ cao [22].
Năm 2010, Chai Junhong và cộng sự, đa nghiên cứu công nghệ trích ly nấm Đầu khỉ bằng công nghệ sóng siêu âm. Quy trình tiến hành 2 lần trong thời gian 45 phút, nhiệt độ 60°C, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi lỏng = 1/15. So với công nghệ truyền thống trích ly bằng nước ấm, trích ly sóng siêu âm giảm tới 4/5 thời gian và lượng dịch chiết Polysaccharides tăng thêm 40% [10].
Năm 2000, Eun Woo Lee và cộng sự, đã nghiên cứu phân lập Diterpenoid erinacines H và I từ nấm Đầu Khỉ bẳng methanol 80% và chứng mình rằng chúng có tác dụng tốt đối với hệ thống thần kinh trong chống bệnh Elzheimer. Cấu trúc của các hợp chất đã được xác định bằng cách phân tích các dữ liệu quang phổ [11].
2.6.2. Tình hình sản xuất và nghiên cứu về nấm Đầu Khỉ ở Việt Nam
Với một nước khí hậu nhiệt đới như Việt Nam thì việc nuôi trồng nấm Đầu Khỉ có rất nhiều khó khăn. Nhưng nhờ vào áp dụng khoa học kỹ thuật và nuôi trồng nấm trong một môi trường khắt khe lần đầu tiên vào năm 1998, viện nghiên cứu Đà Lạt đã thành công trong nuôi trồng loài nấm này, nhưng sản lượng nấm ít chỉ đáp ứng cho các đề tài nghiên cứu.
Cuối năm 2000, chi nhánh công ty Đông Nam dược Bảo Long tại Hà Tây cũng đã thử nghiệm nuôi trồng ở nhiệt độ 17 - 250C và thu được kết quả khả quan. Năm 2001, Tiến sĩ. Lê Xuân Thám (viện hạt nhân Đà Lạt) kết hợp với trường Đại học thành phố Hồ Chí Minh đã chọn lọc và nuôi trồng ra quả thể hoàn chỉnh tại thành phố Hồ Chí Minh. Ông cũng cho biết quả thể nấm Đầu Khỉ thu được vào mùa mưa có tua dài và trắng đẹp hơn so với quả thể thu được vào mùa khô [7].
Các chuyên gia thuộc Công ty cổ phần dược liệu Trung ương 2 đã tạo được dòng nấm Đầu Khỉ sinh trưởng trong điều kiện nhiệt độ cao (từ 28 đến 330C). Với thành công này người tiêu dùng Việt Nam đã có cơ hội thưởng thức các món ăn ngon, giàu chất dinh dưỡng chế biến từ nấm đầu khỉ phổ biến ở các nước châu Âu. Cho tới nay, loài nấm này đã được trồng ở quy mô lớn tại Lâm Đồng trong điều kiện bình thường có nhà lưới bao quanh, mái lợp tôn và không cần tác động về nhiệt độ. Tính tới tháng 10 năm 2005, công ty đã sản xuất được 6000 tấn nấm tươi và đang bán dưới dạng sấy khô [1].
Tổng sản lượng các loại nấm ăn và nấm dược liệu của Việt Nam hiện nay đạt trên 100.000 tấn/năm, kim ngạch xuất khẩu khoảng 40 triệu USD/năm, riêng nấm Đầu Khỉ đạt khoảng 6.000 tấn. So với nấm dược liệu như nấm Hương, nấm Linh Chi... con số này còn rất nhỏ. Hiện nay, tại nhiều nơi như Sơn La, Sapa, Hà Nội, Hưng Yên, Vĩnh Phúc, Ninh Bình, Hồ Chí Minh, Đà Lạt bắt đầu trồng thử nghiệm loại nấm này [8].
Từ năm 2005, sau gần 2 năm thực hiện, nhóm các nhà khoa học của Trung tâm nghiên cứu Linh Chi và nấm dược liệu thành phố Hồ Chí Minh và Hội sinh học thành phố Hồ Chí Minh (thuộc Liên hiệp các hội khoa học và kỹ thuật thành phố Hồ
Chí Minh) đã thực hiện thành công dự án “Nghiên cứu quy trình công nghệ trồng nấm hầu thủ chịu nhiệt”. Ngoài việc cung cấp thêm một món ăn mới trong bữa ăn hàng ngày cho người tiêu dùng, thành công của dự án này còn mở ra một triển vọng trồng nấm hầu thủ để sử dụng làm nguyên liệu cho ngành dược và xuất khẩu [3].
Nấm Đầu Khỉ đang mở ra một hướng phát triển mới cho ngành trồng nấm.việc xuất khẩu sẽ mang lại nguồn lợi rất lớn. Tuy nhiên nấm Đầu Khỉ vẫn còn khá xa lạ với người dân Việt Nam.Việc nuôi trồng nấm vẫn chưa được quan tâm và phổ biến rộng rãi. Nấm Đầu Khỉ còn khá mới đối vối Việt Nam nên những nghiên cứu về nấm chỉ hạn chế ở việc nuôi trồng nấm đạt năng quả chứ chưa chú trọng đến việc trích ly các hợp chất thành các sản phẩm chức năng.
Phần 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng, hoá chất và thiết bị nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng
Nguồn nấm Đầu khỉ (Hericium erinaceus) được thu mua tại công ty TNHH nấm Linh Chi ngõ 330 Nguyễn Trãi - Thanh Xuân - Hà Nội.
Nấm Đầu khỉ thu mua ở dạng nguyên liệu khô, sau khi mua về được đem đi xác định độ ẩm để điều chỉnh độ ẩm về mức an toàn (13%) và được bảo quản kín trong túi nilon ở nơi thoáng mát để tránh ẩm mốc.
3.1.2. Hoá chất và thiết bị
3.1.2.1. Hóa chất
Cồn (960), nước cất, phenol, methanol, acetone, vanilin, acid sunfuric (96%)…
3.1.2.2. Thiết bị và dụng cụ
Máy sấy (Grot DZ 47-63, Trung Quốc)
Máy đo OD (Zuzi 4110ED Spectrophotometer, Đức) Máy siêu âm (Ultrasonic LC30, Đức)
Cân phân tích (Precisa XT 320M, Thụy Sỹ) Thiết bị Soxhlet (TC 15, Trung Quốc)
Cân kỹ thuật (Cent-0-Gram Balance, OHAUS, Mỹ) Tủ lạnh (Samsung SR-15NFBA, Nhật bản)
Máy xay (Điện cơ An Phát, Việt Nam)
Bình tam giác, bình định mức, pipet, đĩa péptri...
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
Địa điểm: Bộ môn Nghiên cứu phụ phẩm và môi trường nông nghiệp - Viện Cơ điện Nông nghiệp và CNSTH, 126 Trung Kính, Trung Hòa, Cầu Giấy, Hà Nội.
Thời gian: Từ tháng 12/2013 đến tháng 5/2014
3.3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện xử lý nguyện liệu đến hiệu quả trích ly Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ
- Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu quả trích ly Diterpenoid
Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi đến hiệu quả trích ly