Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ
a. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu quả trích ly Diterpenoid
Nấm Đầu khỉ khô có độ ẩm 13% được làm nhỏ ở các kích thước khác nhau để có thể lựa chọn được một kích thước tối ưu nhất. Nấm Đầu Khỉ được xay ở các kích thước phù hợp. Ở đây chúng tôi tiến hành khảo sát ở các loại kích thước theo các công thức:
Công thức Kích thước (mm)
CT1 d > 10
CT2 5 < d ≤10
CT3 2 < d ≤ 5
CT4 d ≤ 2
Nấm Đầu Khỉ với các kích thước trên được đem trích ly ở cùng điều kiện.Ban đầu chúng tôi cố định các điều kiện để dễ dàng cho quá trình nghiên cứu:
- Khối lượng mẫu: 10g
- Sử dụng dung môi là: Ethanol - Nồng độ dung môi: 80%
- Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là: 1/20 - Trích ly Soxhlet
- Nhiệt độ trích ly: 600C - Thời gian trích ly: 3h
Dịch trích ly thu được đem lọc qua giấy lọc thô 2 lần và lọc qua giấy lọc tinh 1 lần. Sau đó, đo OD ở bước sóng 610nm để xác định hàm lượng Diterpenoid, các thí nghiệm lặp lại 3 lần. Thí nghiệm này xác định được kích thước nguyên liệu phù hợp nhất và làm cơ sở cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi đến hiệu quả trích ly hoạt chất sinh học Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ
a. Ảnh hưởng của loại dung môi đến hiệu quả trích ly Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ
Việc sử dụng loại dung môi nào cho trích ly là rất quan trọng, vì dung môi để hoà tan các chất cần trích ly và hạn chế hòa tan các tạp chất, do đó dung môi có ảnh
hưởng lớn tới chất lượng của dịch chiết và thành phẩm. Dựa trên tính chất vật lý (độ nhớt, sức căng bề mặt, độ phân cực) và đặc tính hoà tan chọn lọc của dung môi đối với hoạt chất để lựa chọn dung môi. Chúng tôi tiến hành khảo sát với 3 loại dung môi sau:
Công thức Dung môi
CT1 Acetone
CT2 Ethanol
CT3 Methanol
Nấm Đầu Khỉ được đem trích ly ở cùng điều kiện. Ban đầu chúng tôi cố định các điều kiện để dễ dàng cho nghiên cứu.
- Khối lượng mẫu: 10g
- Kích thước nguyên liệu: Theo mục 3.4.3.1.a - Nồng độ dung môi: 80%
- Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là: 1/20 - Trích ly Soxhlet
- Nhiệt độ trích ly: 600C - Thời gian trích ly: 3h
Dịch trích ly thu được đem lọc qua giấy lọc thô 2 lần và lọc qua giấy lọc tinh 1 lần. Sau đó, đo OD ở bước sóng 610nm để xác định hàm lượng Diterpenoid, các thí nghiệm lặp lại 3 lần. Thí nghiệm này nhằm xác định được dung môi thích hợp nhất cho qua trình trích lý Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ và làm cơ sở cho các thí nghiệm tiếp theo.
b. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hiệu quả trích ly Diterpenoid
Việc lựa trọn nồng độ dung môi thích hợp sẽ giúp nâng cao hiểu qua trích ly các hoạt chất sinh học. Tôi tiến hành khảo sát dung môi ở các nông độ sau:
Công thức Nồng độ (%)
CT1 80
CT2 85
CT3 90
Nấm Đầu Khỉ được đem trích ly ở cùng điều kiện. Ban đầu chúng tôi cố định các điều kiện để dễ dàng cho nghiên cứu.
- Khối lượng mẫu: 10g
- Kích thước nguyên liệu: Theo mục 3.4.3.1.a - Dung môi: Theo mục 3.4.3.2. a
- Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là: 1/20 - Trích ly Soxhlet
- Nhiệt độ trích ly: 600
C - Thời gian trích ly: 3h
Dịch trích ly thu được đem lọc qua giấy lọc thô 2 lần và lọc qua giấy lọc tinh 1 lần. Sau đó, đo OD ở bước sóng 610nm để xác định hàm lượng Diterpenoid, các thí nghiệm lặp lại 3 lần. Từ thí nghiệm tìm ra được nồng độ dung môi tốt nhất và làm cơ sở cho các thí nghiệm sau.
c. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến hiệu quả trích ly Diterpenoid
Khi tiến hành trích ly cần phải lựa chọn tỷ lệ nguyên liệu/dung môi sao cho phù hợp. Nếu tỷ lệ nguyên liệu/dung môi thấp thì không chiết được hết Diterpenoid có trong nguyên liệu. Nếu tỷ lệ nguyên liệu/dung môi cao thì sẽ tốn kém dung môi và tốn năng lượng và thời gian hơn cho công đoạn sau. Chúng tối tiến hành khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi theo 4 công thức sau:
Công thức Tỷ lệ
CT1 1/10
CT2 1/15
CT3 1/20
CT4 1/25
Nấm Đầu Khỉ được đem trích ly ở cùng điều kiện. Ban đầu chúng tôi cố định các điều kiện để dễ dàng cho nghiên cứu:
- Khối lượng mẫu: 10g
- Kích thước nguyên liệu : Theo mục 3.4.3.1.a - Dung môi: Theo mục 3.4.3.2. a
- Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là: Theo mục 3.4.3.2.c - Trích ly Soxhlet
- Nhiệt độ trích ly: 600
C - Thời gian trích ly: 3h
Dịch trích thu được đem lọc qua giấy lọc thô 2 lần và lọc qua giấy lọc tinh 1 lần. Sau đó đo OD ở bước sóng 610nm để xác định hàm lượng Diterpenoid, các thí nghiệm lặp lại 3 lần. Từ thí nghiệm tìm ra được tỷ lệ nguyên liệu/dung môi tốt nhất và làm cơ sở cho các thí nghiệm sau.
3.4.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng các thông số trích ly tới hiệu quả trích ly Diterpenoid hoạt chất sinh học trong nấm Đầu khỉ Diterpenoid hoạt chất sinh học trong nấm Đầu khỉ
a. Ảnh hưởng của phương pháp trích ly đến hiệu quả trích ly
Phương pháp trích ly ảnh hưởng rất lớn đến khả năng trích ly các hoạt chất hòa tan có trong nấm Đầu khỉ. Nếu chọn được một phương pháp thích hợp thì sẽ tách triệt để các chất và cho hiệu suất cao. Tuy nhiên, mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm riêng nên cần nghiên cứu để tìm ra một phương pháp tốt nhất. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với 3 phương pháp trích ly sau:
Công thức Phương pháp trích ly
CT1 Ngâm ở điều kiện thường CT2 Trích ly cách thủy CT3 Trích ly bằng soxhlet
Nấm Đầu Khỉ được trích ly ở cùng một điều kiện. Để dễ dàng cho nghiên cứu chúng tôi cố định các điều kiện sau:
- Khối lượng mẫu: 10g
- Kích thước nguyên liệu : Theo mục 3.4.3.1.a - Dung môi: Theo mục 3.4.3.2. a
- Nồng độ dung môi: Theo mục 3.4.3.2.b
- Tỷ lệ nguyên liệu trên dung môi: Theo mục 3.4.3.2.c - Nhiệt độ trích ly: 600
C - Thời gian trích ly: 3h
Mỗi công thức lặp lại 3 lần. Dịch trích ly thu được đem lọc, đo OD để xác định hàm lượng Diterpenoid. Từ đó sẽ tìm được phương pháp trích ly tối ưu cho hiệu quả cao nhất. Thí nghiệm này nhằm xác định được phương pháp trích ly thích hợp nhất cho quá trình trích ly Diterpenoid và là cơ sở cho các thí nghiệm tiếp theo.
b. Nghiên cứu xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình trích ly Diterpenoid
Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến quá trình trích ly do đó cần xác định được nhiệt độ thích hợp nhất. Chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ trích ly ở các mốc nhiệt độ theo 4 công thức sau:
Công thức Nhiệt độ (0C)
CT1 50
CT2 60
CT3 70
CT4 80
Nấm Đầu Khỉ được đem trích ly ở cùng điều kiện. Ban đầu chúng tôi cố định các điều kiện để dễ dàng cho nghiên cứu:
- Khối lượng mẫu: 10g
- Kích thước nguyên liệu: Mục 3.4.3.1.a - Dung môi: Theo mục 3.4.3.2.a
- Nồng độ dung môi: Theo mục 3.4.3.2.b - Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi: Mục 3.4.3.2.c - Phương pháp trích ly: Theo mục 3.4.3.3.a - Thời gian trích ly: 3h
Dịch trích ly thu được đem lọc qua giấy lọc thô 2 lần và lọc qua giấy lọc tinh 1 lần. Sau đó đo OD ở bước sóng 610nm để xác định hàm lượng Diterpenoid, các thí nghiệm lặp lại 3 lần.Từ thí nghiệm tìm ra được nhiệt độ thích nhất cho quá trình trích ly Diterpenoid và làm cơ sở cho các thí nghiệm sau.
c. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hiệu quả trích ly Diterpenoid
Thời gian có ảnh hưởng đến quá trình trích ly. Nếu thời gian chiết ngắn sẽ không chiết hết hoạt chất trong nguyên liệu, nếu thời gian trích ly quá dài, dịch trích
ly sẽ lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản. Do đó cần phải lựa chọn được thời gian thích hợp cho quá trình trích ly. Chùng tôi tiến hành thí nghiệm ở các mốc thời gian theo 3 công thức sau:
Công thức Thời gian (giờ)
CT1 3
CT2 4
CT3 5
Nấm Đầu Khỉ được đem trích ly cách thủy ở cùng điều kiện. Ban đầu chúng tôi cố định các điều kiện để dễ dàng cho nghiên cứu:
- Khối lượng mẫu: 10g
- Kích thước nguyên liệu: Mục 3.4.3.1.a - Dung môi: Theo mục 3.4.3.2.a
- Nồng độ dung môi: Theo mục 4.4.3.2.b - Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi: Mục 3.4.3.2.c - Phương pháp trích ly: Theo mục 3.4.3.3.a - Nhiệt độ trích ly: Theo mục 3.4.3.3.b
Dịch trích ly thu được đem lọc qua giấy lọc thô 2 lần và lọc qua giấy lọc tinh 1 lần. Sau đó đo OD ở bước sóng 610nm để xác định hàm lượng Diterpenoid, các thí nghiệm lặp lại 3 lần.Từ thí nghiệm tìm ra được thời gian thích hợp nhất cho quá trình trích ly Diterpenoid và làm cơ sở cho các thí nghiệm sau.
d. Nghiên cứu ảnh hưởng của số lần trích ly đến hiệu quả trích ly Diterpenoid
Sau khi trích ly lần 1, tiến hành lọc dịch trích ly loại bã. Bã trích ly của lần 1 được tiếp tục đem đi trích ly tiếp nhằm trích ly triệt để hàm lượng Diterpenoid có trong nấm Đầu Khỉ. Chúng tôi tiến hành thí nghiêm theo 2 công thức sau:
Công thức Số lần trích ly
CT1 2
CT2 3
Nấm Đầu Khỉ được trích ly ở cùng một điều kiện. Để dễ dàng cho nghiên cứu chúng tôi cố định các điều kiện sau:
- Khối lượng mẫu: 10g
- Kích thước nguyên liệu: Mục 3.4.3.1.a - Dung môi: Theo mục 3.4.3.2.a
- Nồng độ dung môi: Theo mục 4.4.3.2.b - Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi: Mục 3.4.3.2.c - Phương pháp trích ly: Theo mục 3.4.3.3.a - Nhiệt độ trích ly: Theo mục 3.4.3.3.b - Thời gian trích ly: Theo mục 3.4.3.3.c
Dịch trích ly thu được đem lọc qua giấy lọc thô 2 lần và lọc qua giấy lọc tinh 1 lần. Sau đó đo OD ở bước sóng 610nm để xác định hàm lượng Diterpenoid, các thí nghiệm lặp lại 3 lần.Từ thí nghiệm tìm ra được số lần trích ly nhằm trích ly được triệt để nhất hàm lượng Diterpenoid có trong nấm Đầu Khỉ.
3.4.4.4. Lọc, cô dịch trích ly và thu nhận chế phẩm Diterpenoid trong nấm Đầu Khỉ
Dịch trích ly của nấm Đầu Khỉ sau khi trích ly xong sẽ lẫn rất nhiều tạp chất, và vẩn đục. Vì vậy, trước khi đem đi cô dịch cần phải lọc để đảm bảo dịch chiết trong, không lẫn các tạp chất khác mà chỉ chứa các chất hòa tan có trong nấm. Sau đó, chúng tôi tiến hành cô dịch trên thiết bị chân không ở áp suất -0,8atm với các mốc nhiệt độ như sau:
Công thức Nhiệt độ (0C) CT1 50 CT2 60 CT3 70 CT4 80 CT5 90
Dịch thô sau khi cô được lấy mẫu đi đo mật độ OD ở bước sóng 610nm để xác định hàm lượng Diterpenoid.
Thí nghiệm xác định được nhiệt độ cô đặc phù hợp nhất cho quá trình thu nhận chế phẩm diterpenoid từ nấm Đầu Khỉ.
Phần 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện xử lý nguyện liệu đến hiệu quả trích