Qua nghiên cứu bản đồ cắt hạn chế của gen seb, sơ đồ cấu trúc của vector biểu hiện pET22(b+) và vector tách dòng pJET1.2/bunt, chúng tôi nhận thấy hai điểm cắt của enzym cắt hạn chế là EcoRI và HindIII không có trong trình tự gen seb, vector pJET1.2/bunt và có trong vùng đa tách dòng vector pET22(b+). Chính vì vậy, khi thiết kế mồi cho PCR chúng tôi đã thiết kế thêm trình tự của enzym EcoRI và HindIII ở hai đầu đoạn gen seb (đầu 5’và đầu 3’), nhằm nhân được đoạn gen seb có chứa trình tự của hai enzym này ở hai đầu. Với thiết kế như trên chúng tôi sẽ nhân được nguyên vẹn chiều dài đoạn gen và giữ đúng khung đọc thông suốt khi đưa vào vector biểu hiện pET22(b+) từ vị trí mở đầu trên vector, thông qua đoạn gen seb, 6 amino acid histidine và kết thúc ở bộ ba kết thúc. Đầu tiên, gen seb được nhân dòng trong pJET1.2/blunt với cặp mồi SEB Exp-F và SEB Exp-R với mục đích tạo được protein tái tổ hợp hoàn chỉnh, không bị lẫn một số amino acid nằm trong vùng đa nối của vector pET22b(+). Tiếp theo, đoạn gen seb và vector biểu hiện pET22(b+) được cắt mở vòng bằng hai enzym EcoRI và HindIII để tạo đầu so le, sau đó được tinh sạch và ghép nối với nhau tạo vector tái tổ hợp pET22(b+) mang gen seb đột biến nhờ xúc tác của T4 DNA ligase. Sản phẩm ghép nối được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5 rồi chọn lọc dòng tế bào chứa vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc và cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng hai enzym hạn chế.
Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc để chọn dòng mang plasmid tái tổ hợp pET22b+/mtSEB. M. Thang DNA chuẩn 1 kb; 1: Đối chứng âm; 2-4: Sản phẩm PCR trực tiếp của các dòng khuẩn lạc khác nhau mang gen seb đột biến
M 1 2 3 4 534 500 250 1000 bp
K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 49
Kết quả PCR trực tiếp từ các dòng khuẩn lạc khác nhau (colony-PCR) với cặp mồi đặc hiệu của gen mtSEB (SEB Exp-F và SEB Exp-R) cho thấy cả 3 dòng khuẩn lạc đều cho một băng DNA có kích thước khoảng 534 bp (Hình 3.9), kết quả này phù hợp với tính toán lý thuyết.
Tiếp tục kiểm tra các dòng có colony-PCR dương tính bằng phương pháp cắt plasmid bằng hai enzym hạn chế EcoRI và HindIII. Kết quả thu được trên hình 3.10 cho thấy ở các giếng 1, 2, 3 sản phẩm cắt phân thành 2 băng tương ứng với kích thước của vector pET22b(+) khoảng 5500 bp và kích thước của đoạn gen seb khoảng 534 bp phù hợp với tính toán lý thuyết. Như vậy, chúng tôi đã thiết kế thành công vector biểu hiện pET22b(+)/mtSEB. Gen seb đột biến trong vector biểu hiện sẽ được giải trình tự để khẳng định lại gen đích.